中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科(沈陽(yáng) 110001) 李良滿 李靜波 朱 悅

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)繼發(fā)性損傷機(jī)制復(fù)雜,目前臨床上還缺乏更多有效的治療藥物。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn),補(bǔ)體系統(tǒng)在 SCI中起到了重要作用,抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活可以減輕繼發(fā)性 SCI[1]。近幾年來(lái),SCI的抗補(bǔ)體治療越來(lái)越引起人們的關(guān)注。而開(kāi)發(fā)尋找高效、安全、低成本的補(bǔ)體抑制劑亦成為相關(guān)研究熱點(diǎn)和方向[2]。草麻黃(Ephedra sinica,ES)較早地被應(yīng)用于急性腎炎、支氣管哮喘等與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的治療中,獲得了顯著的療效,其作用機(jī)制被認(rèn)為與抑制補(bǔ)體活化有關(guān)[3]。隨著生物化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,其抗補(bǔ)體成分已被成功的分離提取,并被證明具有強(qiáng)力的補(bǔ)體抑制作用[4]。本研究首次將草麻黃補(bǔ)體抑制成分應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性的 SCI治療中,探討其對(duì)SCI后補(bǔ)體系統(tǒng)激活的影響,為 SCI的抗補(bǔ)體治療提供更多的理論依據(jù)。

材料和方法

1 草麻黃補(bǔ)體抑制成分的提純及活性鑒定 參照 Ling等的方法應(yīng)用多步沉淀及薄層層析方法進(jìn)行草麻黃補(bǔ)體抑制成分的提純并進(jìn)行活性鑒定,1kg草麻黃加入 pH4.0的蒸餾水 10L,煮沸 1h,過(guò)濾除渣,加入 1mol/L NaOH調(diào)整 pH至 9.0室溫?cái)嚢璺跤?1h,離心,洗滌沉淀 3次,室溫烘干得到棕褐色粗品共 18.5g。取 3g粗品溶于 pH4.0的蒸餾水 50ml中,煮沸 1h,離心棄上清,溶于 pH 9.0的蒸餾水中,調(diào)整 pH值至4.0,進(jìn)行薄層層析,微量法進(jìn)行補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)測(cè)定,結(jié)果證明最快速移動(dòng)層析帶具有顯著的抗補(bǔ)體活性。重復(fù)以上步驟進(jìn)行提取收集備用。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及脊髓損傷模型制備 健康 SD大鼠 50只,SPF級(jí),雌雄不拘,體重 250～ 300g,隨機(jī)分組:①實(shí)驗(yàn)組 (ES組):分脊髓損傷后 12h、1d、3d、7d、14d五個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn) n=5,傷后 1h給予ES補(bǔ)體抑制成分提取物 (15mg/kg)溶于 5ml生理鹽水強(qiáng)制灌胃,1次 /d。② 對(duì)照組(Control組):分脊髓損傷后 12h、1d、3d、7d、14d五個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn) n=5,以同樣方法給予等量生理鹽水。采用改良的Allen’s重物打擊法[5]方法制備大鼠脊髓急性損傷模型:損失部位為 T10節(jié)段。

3 血清總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定 應(yīng)用 CH50法進(jìn)行血清總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定。在大鼠 SCI前 1h、傷后12h及傷后每天尾靜脈抽血 0.3ml,離心,取上清,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽?2%綿羊紅細(xì)胞懸液,溶血素效價(jià)測(cè)定,制備 50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管,然后將各濃度梯度反應(yīng)體系置于微量板孔中,反應(yīng)完畢后,在 541nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,計(jì)算出待測(cè)血清的 CH50值,并與損傷前血清樣品的基礎(chǔ)值比較,計(jì)算出百分比值。

4 組織病理學(xué)觀察 各組動(dòng)物于傷后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取 3只再次麻醉,以傷處為中心取 1cm脊髓組織,制作片厚為 12 μ m的冰凍切片,分別行 HE染色及免疫組織化學(xué)染色。采用 SABC法進(jìn)行 C3、C9免疫組化染色。試劑盒購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。光學(xué)顯微鏡下,C3及 C9陽(yáng)性反應(yīng)物為突出背景的棕黃色顆粒。應(yīng)用Meta Morph全自動(dòng)真彩色圖像分析儀測(cè)定 C3、C9陽(yáng)性反應(yīng)物平均灰度值(Average gray value,AG)。 AG與陽(yáng)性反應(yīng)物的免疫反應(yīng)強(qiáng)度呈反比關(guān)系。

結(jié) 果

1 血清 CH50測(cè)定結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,傷后早期血清 CH50比值迅速下降,約在傷后 1d達(dá)到最低值,分別 29.05% ± 2.08%,24.08% ± 2.31%;傷后 3d至 7d快速上升,以后緩慢回升,在傷后 14d,對(duì)照組 CH50接近傷前水平(98.21% ± 1.12%),而在實(shí)驗(yàn)組僅達(dá)到傷前的 75%左右。在傷后 12h實(shí)驗(yàn)組的 CH50比值均低于對(duì)照組,具有顯著性差異(P＜0.05),而在此后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組的 CH50比值均明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。

2 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 傷后 12h,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組脊髓前角部分神經(jīng)元細(xì)胞膜上有散在的 C3及 C9陽(yáng)性顆粒沉積;傷后 3d:兩組整個(gè)灰質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有大量 C3及 C9陽(yáng)性顆粒沉積,其中殘存陽(yáng)性神經(jīng)元的胞膜及胞漿內(nèi)均可見(jiàn) C3及 C9陽(yáng)性顆粒沉積;傷后 7d,兩組灰質(zhì)內(nèi)仍有一定數(shù)量 C3及 C9陽(yáng)性神經(jīng)元,部分神經(jīng)元已基本恢復(fù)了多角形態(tài);損傷后 14d兩組灰質(zhì)內(nèi)仍可見(jiàn) C3及 C9陽(yáng)性表達(dá)。

3 圖像分析結(jié)果 在傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷組織中 C3及 C9 AG值均高于對(duì)照組,且有非常顯著性差異(P＜0.01),表明實(shí)驗(yàn)組 C3及 C9陽(yáng)性表達(dá)明顯弱于對(duì)照組;傷后 3d約是補(bǔ)體免疫反應(yīng)的高峰,見(jiàn)附表。

附表 傷后不同時(shí)間點(diǎn) ES組及 Control組 C3、C9表達(dá)圖像分析結(jié)果 (AG

附表 傷后不同時(shí)間點(diǎn) ES組及 Control組 C3、C9表達(dá)圖像分析結(jié)果 (AG

注:與 Control組比較,* P＜0.01

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討 論

補(bǔ)體系統(tǒng)是構(gòu)成機(jī)體免疫防護(hù)機(jī)制的重要組成部分,也是造成病理性損傷的重要因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)存在補(bǔ)體系統(tǒng)激活的必要條件。補(bǔ)體系統(tǒng)重要固有成分 C3處于經(jīng)典途徑、旁路途徑及 MBL途徑的匯合點(diǎn),在補(bǔ)體系統(tǒng)激活過(guò)程中起著樞紐作用。 C9是形成膜攻擊復(fù)合體(Membrane attack complex,MAC)的最后一個(gè)分子,也是補(bǔ)體系統(tǒng)激活并攻擊破壞靶細(xì)胞的主要成分[6]。

補(bǔ)體系統(tǒng)激活后,會(huì)通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致組織細(xì)胞的病理性損傷。其中 MAC所介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡包括壞死和凋亡兩個(gè)方面。當(dāng) M AC攻擊靶細(xì)胞膜時(shí),在靶細(xì)胞膜上可形成小的雙向的跨膜通道,引起 Ca2+不可抑制性地大量?jī)?nèi)流以及細(xì)胞內(nèi) K+外流、Na+通透性增加等變化,導(dǎo)致膜磷脂的過(guò)氧化,加重血管痙攣、組織缺血,神經(jīng)元細(xì)胞傳導(dǎo)沖動(dòng)的能力減弱或喪失。 MAC還可以通過(guò)激活和裂解 caspase途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡,從而加重繼發(fā)性 SCI[7]。

近年來(lái)大量研究表明,抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活可以減輕 SCI后的繼發(fā)性損傷,抗補(bǔ)體治療有望成為 SCI新的治療策略。 Reynolds[8]等研究發(fā)現(xiàn)痘病毒補(bǔ)體調(diào)控蛋白能夠顯著抑制大鼠 SCI后的補(bǔ)體表達(dá),減輕 SCI。Qiao等研究表明,補(bǔ)體經(jīng)典途徑與旁路途徑在脊髓損傷中起到重要作用,補(bǔ)體抑制劑 CR2-Crry能夠顯著地減輕小鼠 SCI后的神經(jīng)功能損害,抑制補(bǔ)體激活可減輕繼發(fā)性 SCI[9,10]。Tei等[11]研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體 C1酯酶抑制劑能夠顯著抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活,保護(hù)神經(jīng)功能。Guo等[12]研究發(fā)現(xiàn),C3缺失小鼠傷后神經(jīng)元再生功能要顯著優(yōu)于 C3未缺失小鼠,抑制補(bǔ)體激活可減輕繼發(fā)性SCI。我們研究發(fā)現(xiàn),重組補(bǔ)體抑制劑 sCR1可顯著抑制大鼠脊髓損傷后的補(bǔ)體激活,對(duì)神經(jīng)功能發(fā)揮顯著的保護(hù)作用。

本研究首次將 ES補(bǔ)體抑制成分提純后應(yīng)用于大鼠的 SCI模型研究中。結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的SCI組織中均有重要補(bǔ)體固有成分 C3及 C9的表達(dá),并且實(shí)驗(yàn)組的血清 CH50比值、損傷組織中的 C3及C9表達(dá)均明顯低于對(duì)照組,表明 ES補(bǔ)體抑制成分能夠顯著抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活,對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)功能可能發(fā)揮重要的作用,在今后的研究中我們將進(jìn)一步深入探討。本研究為 SCI的抗補(bǔ)體治療提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)。

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