賴黎麗，趙 潔，張 博，王 濤

（1.中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學 草地資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052）

鹽分是影響植物生長和產(chǎn)量的一個重要環(huán)境因子，根據(jù)國內(nèi)外研究資料顯示，鹽脅迫對植物的生長、水分關(guān)系、葉片解剖學、光合色素及蛋白、脂類、離子水平、抗氧化酶及抗氧化劑、氮素代謝、蘋果酸鹽代謝、葉綠體超微結(jié)構(gòu)以及光合作用的機制等方面都有重要的影響［1］。植物的耐鹽機制是一個非常復雜的問題，涉及到生理、生化和分子生物學等方面，各種途徑可能是單獨作用，也可能是協(xié)同作用［2］。隨著功能基因組學的發(fā)展，植物的耐鹽性研究已深入到耐鹽相關(guān)基因的克隆、基因的結(jié)構(gòu)分析以及基因表達特性等領(lǐng)域［3］。對于這些基因的表達方式及其在耐鹽反應中的作用已逐步被了解，植物耐鹽性是由多基因控制的數(shù)量性狀。當植物受到鹽脅迫后，一部分基因的表達量增加，協(xié)同完成脅迫的應答，這類基因稱作鹽誘導基因［4］。目前，大 量的鹽誘導基因已經(jīng)在擬南芥［5］、截型苜蓿［6，7］、煙草［8］、小麥［9］、水稻［10］中分離克隆，并用于遺傳轉(zhuǎn)化。

基因芯片技術(shù)既可以高敏度的定量、定性檢測基因表達水平的差異，也能夠提供某一基因或基因群的表達模式與其他基因表達模式之間關(guān)聯(lián)的信息［11］。在小麥［12］和擬南芥［13］中，已經(jīng)利用cDNA 微陣列大規(guī)模地分析鹽脅迫相關(guān)基因表達譜。疏葉駱駝刺（Alhagi sparsifolia）是多年生豆科植物，具有很強的抗旱、抗霜凍、耐鹽堿能力［13－15］，與基因組序列測定的豆科模式植物截形苜蓿（Medicago truncatula，2n＝16）染色體組相同［16］，是理想的研究植物耐鹽機制的材料。目前，利用微列陣研究疏葉駱駝刺耐鹽相關(guān)基因表達譜的研究尚未見報道。試驗利用Affymetrix公司的MedicagoGenome Array，檢測疏葉駱駝刺在鹽處理0h和24h根部的基因表達差異，尋找耐鹽相關(guān)基因，為進一步克隆耐鹽基因奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和培養(yǎng)條件

實驗以疏葉駱駝刺為材料，材料由新疆農(nóng)業(yè)大學牧草育種與生產(chǎn)實驗室提供。

將種子在4℃冰箱中放置2d進行低溫春化，用98%的濃硫酸處理30min，用移液器將濃硫酸吸干，放在自來水下沖洗30min。在超凈工作臺上，用70%乙醇浸泡1min，然后用0.1%升汞溶液滅菌10min，無菌水清洗5次，放在鋪上2層濾紙培養(yǎng)皿上，黑暗條件下，進行種子萌發(fā)。將萌發(fā)2d后長勢一致的幼苗，用220mmol/L的NaCl溶液進行鹽處理，做3個生物學重復。分別取脅迫時間為0h和24h的根為試驗材料，液氮速凍后，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因芯片分析

利用Affymetrix公司的MedicagoGenome Array，檢測疏葉駱駝刺幼根在鹽處理0h和24h的基因表達譜。截型苜?；蚪M芯片包括61 278個探針?；蛐酒怯刹W生物有限公司生物檢測實驗室操作完成。

1.2.1 RNA提取和探針合成 植物總RNA用天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒方法提取，反轉(zhuǎn)錄用Eukaryotic Poly－A RNA Control Kit試劑盒（Affymetrix）進行反轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄用 Message－AmpTMⅡ（Ambio）進行轉(zhuǎn)錄，同時合成生物素標記的cRNA。生物素標記的cRNA于94℃保溫35min進行片段化。取2μL片段化產(chǎn)物用甲醛變性電泳檢測片段化cRNA大小分布范圍，經(jīng)片段化的cRNA即為雜交用的探針。

1.2.2 芯片預雜及雜交 每張芯片注入250μL預雜交液，置于雜交爐中，45℃，60r/min旋轉(zhuǎn)預雜交10 min，吸出預雜交液，注入相應體積澄清雜交液，將芯片平衡置于雜交爐中，45℃，60r/min旋轉(zhuǎn)雜交16h。

1.2.3 芯片清洗染色及掃描 雜交結(jié)束后，吸凈雜交液，注入與雜交液等體積的Wash Buffer A。利用Affymetrix公司的Fluidics Station 450進行芯片清洗染色，90min，將芯片放入掃描儀中進行掃描。

1.3 基因芯片檢測數(shù)據(jù)的處理

利用Microarray sulteversion 5.0等軟件對芯片掃描所得數(shù)據(jù)進行計算和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因芯片檢測的質(zhì)量分析

以鹽處理0h和24h疏葉駱駝刺幼根為試驗材料，與截型苜?；蛐酒M行雜交，芯片中間的“＋”字、周圍的邊框以及GenechipMedicago等陽性對照信號正常；看家基因信號值及3′/5′比值正常；平均背景值與噪音值較低（表1）；0h和24h的Present Percent分別為8.4%和8.8%，數(shù)值正常。樣品各項檢測參數(shù)達到質(zhì)控要求，達到實驗目的。

表1 質(zhì)量檢測分析報告Table 1 QC Report

2.2 基因芯片檢測結(jié)果

利用Affymetrix公司提供的GCOS軟件對0h和24h芯片的雜交檢測結(jié)果進行了掃描并分析。結(jié)果顯示，在61 278個探針中，0h檢測到的有5 133個，占總探針數(shù)的8.4%，24h檢測到的有5 378個，占總探針數(shù)的8.8%（表2）。

以0h樣品為CK，對擬鹽處理24h樣品的差異基因進行檢測，分別得到與之比較上調(diào)ratio值≥1差異基因127個，下調(diào)ratio值≤－1的差異基因119個，上調(diào)ratio值≥2倍的差異基因有3個。以截型苜蓿在180mmol/L NaCl溶液擬鹽處理24h樣品為CK，對疏葉駱駝刺擬鹽處理24h樣品的差異基因進行比較，共有相同的ratio值≥1和≤－1的差異表達基因50個。其中，在疏葉駱駝刺中表達上調(diào)的基因為33個，下調(diào)的基因為17個。

表2 疏葉駱駝刺0h和24hcRNA與截型苜蓿芯片雜交結(jié)果Table 2 Blotting results of Medicago Genome Array and cRNA of Alhagi sparsifolia under 0hand 24h

2.3 差異表達基因功能初步分析

按照Gene Ontology（GO）分類法則對ratio值≥1和≤－1的差異表達基因以及與截型苜蓿24h的交集差異表達基因在生化過程水平、分子功能水平兩方面進行功能分析。（圖1）

2.3.1 差異表達（ratio值≥1和≤－1）基因的功能分析 由圖1可以看出，經(jīng)鹽脅迫后，在生化過程水平上，主要表達的差異基因參與新陳代謝和細胞壁形成。參與新陳代謝的上調(diào)基因43個，下調(diào)基因33個。參與細胞壁形成的上調(diào)基因44個，下調(diào)基因37個。在分子功能水平上，主要表達的差異基因具有催化活性和綁定活性。具有催化活性的上調(diào)基因45個，下調(diào)基因37個。具有綁定活性的上調(diào)基因34個，下調(diào)基因37個。參與細胞壁形成的上調(diào)基因50個，下調(diào)基因43個。參與細胞器形成是上調(diào)基因39個，下調(diào)基因31個。上下調(diào)一倍以上的基因還有63個未知功能的基因，有待進一步的研究。

2.3.2 上調(diào)一倍以上與截型苜蓿24h的交集差異表達基因功能分析 由表3中的推測基因經(jīng)GO分析可知，經(jīng)鹽脅迫后，與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因有4個，與物質(zhì)能量運輸相關(guān)的基因有9個，與新陳代謝相關(guān)的基因有5個，與逆境相關(guān)的基因有6個。

圖1 差異基因GO分析Fig.1 Differently expressed genes based on GO analysis

表3 上調(diào)交集差異表達基因功能分析Table 3 Function annotation of intersect up－regulated expressed genes

上調(diào)最高的基因是亞鐵血紅素基因（Mhb1，Msa.878.1.S1＿at），參與物質(zhì)運輸，編碼非共生的血色素蛋白，在組織缺氧的情況下誘導表達，與CO信號傳導路徑相關(guān)［17］。富含脯氨酸蛋白基因（PRP2，Mtr.40069.1.S1＿x＿at）是PRPs家族成員，被假設為植物生長調(diào)控、導管分化、抗逆的分子構(gòu)架［18］。甲酸脫氫酶基因（FDH，Mtr.37779.1.S1＿at）屬于 D－2－羥基酸脫氫酶類，可以將甲酸氧化為CO2，同時將NAD＋還原為NADH，維持新陳代謝穩(wěn)定進行［19，20］。

分子在質(zhì)膜和液泡膜中的調(diào)節(jié)運輸是植物響應非生物脅迫的主要特征［21］。由表4可知，具有運輸功能的基因有7個，占下調(diào)基因的63.64%，主要是轉(zhuǎn)運蛋白和質(zhì)膜蛋白。轉(zhuǎn)運蛋白在質(zhì)膜和液泡膜上都存在，一般能夠轉(zhuǎn)運離子、有機大分子和小分子，保證植物體內(nèi)的離子平衡，滲透平衡，物質(zhì)交換與轉(zhuǎn)運。運輸功能的基因大量下調(diào)，說明疏葉駱駝刺幼根響應鹽脅迫后，積累了大量滲透物質(zhì)和能量。

表4 下調(diào)交集差異表達基因功能分析Table 4 Function annotation of intersect down－regulated expressed genes

3 討論

基因表達芯片的檢測能力很大程度上取決于芯片上的探針數(shù)量、代表性和特異性［22］，本研究采用Affymetrix公司的苜?；蚪M芯片，包括48 116個截型苜蓿、1 850個紫花苜蓿和8 226個苜蓿根瘤菌已知表達序列。Affymetrix公司芯片獨特的PM－MM探針對復雜樣品背景的檢測具有高靈敏度和特異性，所獲得的數(shù)據(jù)翔實可靠［23］。同時，在芯片雜交過程中質(zhì)控嚴格，數(shù)據(jù)將更加可靠。鹽脅迫后，檢測到基因5 378個，占總探針數(shù)的8.8%，這可能因為探針序列與目標序列同源性低有關(guān)?，F(xiàn)有研究認為，通過調(diào)整探針信號閾值范圍可以解決這一問題［23］，但疏葉駱駝刺與截型苜蓿親緣關(guān)系較遠，疏葉駱駝刺中或許存在特有基因，苜蓿基因芯片將無法檢測到這些基因，建立疏葉駱駝刺基因組芯片將會解決這一問題。

通過GO分析了上下調(diào)差異表達基因，對其功能進行了分類，發(fā)現(xiàn)與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因有4個，與物質(zhì)能量運輸相關(guān)的基因有16個，與新陳代謝相關(guān)的基因有5個，與逆境相關(guān)的基因有6個。其中非共生的血色素蛋白，在組織缺氧的情況下誘導表達，與CO信號傳導路徑相關(guān)；脯氨酸蛋白基因被假設為植物生長調(diào)控、導管分化、抗逆的分子構(gòu)架；甲酸脫氫酶基因可以將甲酸氧化為CO2，同時將NAD＋還原為NADH，維持新陳代謝穩(wěn)定。此外，我們可以將這些基因在鹽脅迫應答和耐鹽反應中的作用利用分子生物學手段使其過量表達或降低表達加以驗證，從中篩選出具有實際意義上的耐鹽基因，為新型的耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎。

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