李博玲，馬恒東，王 貞

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 雅安 625014）

本試驗旨在研究褪黑素、谷胱甘肽兩種抗氧化劑對精子冷凍的保護效應。通過對冷凍過程中活性氧（ROS）的檢測以及凍后精子活率、活力、頂體完整性、線粒體活性的檢測，篩選出較佳的抗氧化劑添加搭配組合，為豬凍精技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗對象 健康、性欲旺盛成年杜洛克公豬，2008年10月至2009年4月 ，共采精13次。

1.1.2 試劑及耗材 主要試劑：褪黑素（MLT）、碘化炳碇（PI）、羅丹明 123，均為 Sigma公司產(chǎn)品；谷胱甘肽（GSH）、ROS初級熒光檢測試劑盒購自成都溶海生物技術(shù)有限公司；甘油為Amresco公司產(chǎn)品；乳糖購自成都科龍化工試劑廠。

主要耗材：低溫溫度計為北京市宇時技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；倒置熒光顯微鏡為尼康公司生產(chǎn)；電子天平為沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn)；全自動酶標儀為Thermo公司生產(chǎn)；0.5mL冷凍細管為沈陽富士平工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 冷凍稀釋液和解凍液的配制 見表1。

表1 冷凍稀釋液和解凍液的成分和劑量

1.2 試驗設(shè)計 實驗一：在稀釋液中分別單獨添加MLT、GSH，觀察對精液冷凍保存的影響。

實驗二：在稀釋液中聯(lián)合添加MLT、GSH，觀察對精液冷凍保存的影響。

實驗三：聯(lián)合添加與單獨添加兩種抗氧化劑的比較。

1.3 方法

1.3.1 精液預處理及冷凍 用手握法采集中段精液濃稠部分，并立即用BTS等溫稀釋（1∶1），鏡檢活力在0.7以上的用保溫瓶帶回實驗室。室溫靜置2h，用50mL 離心管分裝、離心（2400×g，3min），去上清后加入乳糖-卵黃稀釋Ⅰ液（1∶1），放入4℃冰箱緩慢降溫、平衡約 2h，再加入乳糖-卵黃稀釋Ⅱ液（1∶1）4℃平衡20min后，裝管，液氮熏蒸（離液氮面 5cm，20min），投入液氮保存。

1.3.2 解凍后精液質(zhì)量評定

（1）精子活力檢測：精子活力狀態(tài)利用BI-靜態(tài)分析系統(tǒng)進行觀察、錄像，之后逐一評估。

（2）精子活率和線粒體活性檢測：將解凍的精液用等溫BTS液稀釋，調(diào)整精子密度為3×106個/mL。先取等溫的100μL HEPES/BSA緩沖液置于預溫的1.5mL離心管中，然后加入10μL PI貯存液（取0.004g PI溶于2 mL PBS中，0.45 μm濾膜過濾后，-20℃避光貯存）和1μL羅丹明123貯存液（0.004g羅丹明123溶于2mL DMSO中，0.45μm有機相濾膜過濾后，避光保存），避光孵育10min，最后加入50μL精液，在37℃、黑暗潮濕環(huán)境下孵育30min。取10μL精子懸液于載玻片上，加蓋玻片，熒光顯微鏡（200×）下觀察。死精子在波長540～580nm紫外光激發(fā)下頭部核區(qū)發(fā)出紅色熒光，活精子和有活性線粒體的精子在波長511～534nm紫外光激發(fā)下頭部不發(fā)光，而尾巴線粒體部分（中段）有亮綠色熒光。計算精子活率（活精子百分率）和有線粒體活性的精子百分率。

（3）頂體完整性檢查：進行姬姆薩染色制片鏡檢。①制片：取10μL精液于載玻片一頭，用一邊緣整齊的玻片呈35°角將精液樣品均勻拖布于載玻片上，自然風干，制成精液涂片。②固定：立即吸取10%福爾馬林固定液1～2mL滴于自然風干的涂片上，固定15min，用水輕輕沖洗，洗去固定液，再自然風干。③染色：將姬姆薩染液滴于涂片上，染色1.5h，然后用水輕輕沖洗，晾干備檢。

判定：頂體完整的精子頭部外形正常，細胞膜和頂體完整著色均勻，頂脊、赤道段清晰。鏡檢計數(shù)200個精子，計算頂體完整精子的百分率。頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/總精子數(shù)×100%

（4）ROS測定：利用ROS初級熒光測定試劑盒進行檢測，按說明進行。結(jié)果判定：熒光單位（RFU）值越高，ROS含量越高。

1.4 數(shù)據(jù)處理 應用SPSS13.0 One-Way ANOVA軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單獨添加MLT、GSH對精液冷凍保存的影響

2.1.1 MLT對解凍后精液質(zhì)量的影響 由表2可以看出，添加0.125mg/mL、0.25mg/mL的褪黑素均能顯著提高精子活率（P＜0.05），但兩種濃度之間差異不顯著。當加入0.25mg/mL褪黑素時，能顯著提高精子活力（P＜0.05）；添加 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL褪黑素均能顯著提高凍后精子的頂體完整性（P＜0.05），其中以 0.25 mg/mL 的效果最佳（P＜0.05）；加入0.25 mg/mL褪黑素能顯著提高凍后線粒體活性（P＜0.05）。說明褪黑素對頂體的保護作用較好，同時也能改善活率、活力以及線粒體活性。添加0.125mg/mL、0.25mg/mL的褪黑素，解凍后精子中的ROS含量下降，較對照組差異顯著（P＜0.05），且添加0.25mg/mL的效果最佳（P＜0.05）。

表2 添加不同濃度的MLT對解凍后精子質(zhì)量的影響

2.1.2 GSH對解凍后精液質(zhì)量的影響 由表3可以看出，添加5mmol/L的GSH能極顯著提高精子凍后活率、活力、線粒體活性（P＜0.01）；添加 1mmol/L、5mmol/L的GSH均能顯著提高凍后精子的頂體完整性（P＜0.05），但兩濃度之間差異不顯著；添加GSH能顯著降低凍后精子內(nèi)ROS的含量。當加入10mmol/L GSH時，精子質(zhì)量指標有所下降，說明GSH添加不能過量。

表3 添加不同濃度的GSH對解凍后精子質(zhì)量的影響

2.2 MLT與GSH聯(lián)合添加對解凍后精液質(zhì)量的影響 多重比較結(jié)果表明，對于活率，M1G1、M1G2顯著優(yōu)于 M2G1，M2G2顯著優(yōu)于 M2G1（P＜0.05），M1G1、M1G2顯著優(yōu)于M2G2（P＜0.05）；對于活力，M1G1顯著優(yōu)于M2G1和M2G2，M1G2顯著優(yōu)于M2G1（P＜0.05）；對于頂體完整率和線粒體活性，各組之間差異顯著，M1G1顯著優(yōu)于其他各組（P＜0.05）?？偟膩碚f，M1G1為聯(lián)合添加最佳組合。

表4 MLT與GSH交互作用的組內(nèi)比較

2.3 單獨添加與聯(lián)合添加抗氧化劑的比較 由表5可以看出，聯(lián)合添加MLT與GSH較單獨添加，其精子活率、活力、頂體完整性有顯著提高（P＜0.05）；線粒體活性無顯著差異；單獨添加與聯(lián)合添加MLT、GSH均能顯著降低ROS含量（P＜0.05）。聯(lián)合添加與單獨添加的效果差異顯著（P＜0.05），說明MLT與GSH之間存在顯著的交互效應。

表5 單獨添加與聯(lián)合添加的比較

3 分析

MLT在本次試驗中是第一次用于豬精液的冷凍保存。商學軍等（2004）曾在精子模型中加入MLT共同孵育，觀察其對線粒體功能的保護作用，結(jié)果顯示MLT通過清除ROS，對精子線粒體具有重要的保護作用。本試驗在冷凍稀釋液中加入MLT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入0.25mg/mL時，精子活率、活力、線粒體活性、頂體完整性都有顯著提高（P＜0.05），且解凍后精子ROS含量顯著下降（P＜0.05）。GSH是一種重要的抗氧化劑，其本身易受某些物質(zhì)氧化，所以它在體內(nèi)能夠保護許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被自由基等有害物質(zhì)氧化。GSH能直接與過氧化氫等氧化劑結(jié)合，生成水和氧化型谷胱甘肽。本試驗在冷凍稀釋液中加入5mmol/L的GSH，結(jié)果顯著提高了凍后精子的活率、活力及線粒體活性（P＜0.05）。

4 結(jié)論

褪黑素與谷胱甘肽具有顯著的交互效應，褪黑素的存在提高了谷胱甘肽的抗氧化效率，因此，只有將兩種抗氧化劑同時用于豬精液冷凍保存，才能更好地保護豬精子免受抗氧化損傷，達到提高解凍后精子質(zhì)量的目的。

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