萬(wàn)勝化風(fēng)丹、雄黃和朱砂的急性肝腎毒性作用

顏俊文，苗加偉，何海洋，時(shí)京珍，吳 芹，劉 杰，石京山

(1.貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州遵義 563003;2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550002)

萬(wàn)勝化風(fēng)丹由天麻、僵蠶、全蝎、天南星、荊芥、雄黃、藥母、麝香、朱砂、硼砂、巴豆霜和冰片等15味中藥經(jīng)獨(dú)特的下窖發(fā)酵及風(fēng)干工藝制作而成的傳統(tǒng)中成藥，用于風(fēng)痰閉阻(頭痛、耳鳴、腦動(dòng)脈硬化、肢體麻木無力及腦萎縮)，中風(fēng)偏癱，癲癇，面神經(jīng)麻痹，口眼歪斜等癥的治療，1951年被列入國(guó)務(wù)院保護(hù)的四大名藥之一。

萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方含雄黃和朱砂約10%，眾所周知，雄黃和朱砂為砷和汞化合物，近年來，其安全性問題備受關(guān)注，因此，在原方基礎(chǔ)上，雄黃、朱砂用量減少了約2/3。但減量方療效下降，其毒性變化未知。為了進(jìn)一步探究雄黃、朱砂及其在萬(wàn)勝化風(fēng)丹中的肝、腎毒性，本研究采用一次性ig給予萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、雄黃和朱砂減量的萬(wàn)勝化風(fēng)丹(減量方藥)、不含雄黃和朱砂的萬(wàn)勝化風(fēng)丹(減方藥)、與原方藥等量的雄黃和朱砂單藥、亞砷酸鈉和氯化汞，比較其肝腎毒性，為客觀評(píng)價(jià)含雄黃和朱砂中藥的肝腎毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品

萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥均由貴州萬(wàn)勝藥業(yè)公司提供。雄黃和朱砂購(gòu)自貴州德昌祥藥廠。

1.2 試劑和主要儀器

Trizol:寶生物工程(大連)有限公司，焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC):Sigma公司，SYBR?GREEN PCRMaster Mix，ABI公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:寶生物工程(大連)有限公司。自動(dòng)血生化檢測(cè)儀(日本Olympus公司);Lido-49型原子熒光光譜儀(北京科創(chuàng)海光儀器有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀，美國(guó) Bio-Rad公司;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Eppendorf5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，22331多功能梯度PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 動(dòng)物分組及方法

昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):0002438。

48只昆明種小鼠隨機(jī)分成8組，每組6只。正常對(duì)照組給予蒸餾水;萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥3 g·kg－1、減量方藥3 g·kg－1(雄黃和朱砂用量減少了約2/3)、減方藥 3 g·kg－1，雄黃 0.3 g·kg－1組(與原方藥含汞量相當(dāng))，朱砂 0.3 g·kg－1組(與原方藥含汞量相當(dāng))，亞砷酸鈉 36 mg·kg－1組(原方藥含砷量的10%)和氯化汞 0.07 g·kg－1組(原方藥含砷量的20%)。各組均一次性ig給藥。

1.4 血液生化指標(biāo)的檢測(cè)

小鼠ig給藥后8 h后斷頭處死，取血，2500×g離心10 min，自動(dòng)血生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，肌酐(creatinine，Cre)水平。

1.5 測(cè)量肝、腎組織中As和Hg含量

取肝，腎組織各約100 mg，分別放入消化罐中，用刻度吸管加入65%H2NO35 ml，置烤箱中165℃消化2 h。自然冷卻后，將消化罐內(nèi)液體倒入50 ml刻度管中并用去離子水定容到25 ml，混勻。從50 ml刻度管取5 ml樣品消化液入另一試管，在此試管加入1 ml 5% 硫脲-抗壞血酸溶液混合，反應(yīng)30 min，用原子熒光光譜儀檢測(cè)砷和汞含量。

1.6 HE染色觀察肝腎組織病理變化

取肝中葉適當(dāng)大小，腎縱切后的1/2迅速放入4%多聚甲醛中固定，送病理科石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖像。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)肝、腎組織金屬硫蛋白基因metallothionein 1(MT-1)mRNA表達(dá)

取肝、腎組織各50～100 mg，按PCR試劑盒操作提取mRNA，純化，逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR儀檢測(cè)基因表達(dá)。引物由寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，MT-1同義鏈:5'-AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3'反義鏈:5'-GCTGGGTTGGTCCGATACTATT-3'。用2△Ct法定量數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)肝腎功能的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，亞砷酸鈉36 mg·kg－1ALT 增高，朱砂 0.3 g·kg－1、氯化汞 0.07 g·kg－1組Cre和BUN均明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05);與原方藥組相比，氯化汞 0.07 g·kg－1Cre和BUN顯著增高(P＜0.05);說明了亞砷酸鈉對(duì)肝有損害，氯化汞對(duì)腎有損害。

2.2 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)肝腎組織中砷、汞蓄積的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，除減方組與雄黃0.3 g·kg－1外，其余各組肝腎組織中砷的蓄積量明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與原方藥組相比，亞砷酸鈉36 mg·kg－1肝腎組織中砷的蓄積量明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，表明肝腎組織中砷的蓄積量與化風(fēng)丹中雄黃含量的高低直接相關(guān)，萬(wàn)勝化風(fēng)丹比單用雄黃更易引起砷在肝腎的蓄積，說明復(fù)方與單味藥之間的差異，盡管亞砷酸鈉組砷的用量只有原方藥的10%，砷在肝腎組織中的蓄積卻是原方藥的5倍，說明不同價(jià)態(tài)的砷在體內(nèi)分布是有顯著差別的。

表1 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)小鼠肝腎功能的影響Tab.1 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on hepatic and renal function of mice

表2 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥在肝腎組織中砷蓄積的影響Tab.2 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on arsenic accumulation in the liver and kidneys of mice

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，除減方藥外，其他各組肝、腎組織汞的蓄積量增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與原方藥組相比，氯化汞0.07 g·kg－1引起汞在肝腎組織中蓄積增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)，朱砂0.3 g·kg－1組腎汞蓄積增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。說明復(fù)方中的汞比朱砂單用易于在肝內(nèi)蓄積，而朱砂單用比復(fù)方中的汞更易在腎蓄積，氯化汞比其他各組更易引起肝腎組織中汞的蓄積，以腎組織中汞蓄積量最多。

表3 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)肝腎組織中汞蓄積的影響Tab.3 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on mercury accumulation in the liver and kidneys of mice

2.3 勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)肝腎組織的病理?yè)p傷

由圖1可知，正常對(duì)照組肝組織染色均勻，細(xì)胞排列整齊有序。與正常對(duì)照組(圖1A)相比，亞砷酸鈉組(圖1D)、氯化汞組(圖1F)肝細(xì)胞腫脹、嗜酸性變性、點(diǎn)狀細(xì)胞凋亡和壞死;而萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥組(圖1B)、雄黃組(圖1C)、朱砂(圖1E)組病變輕微。

圖1 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)小鼠肝組織損傷的病理影響 (HE ×200).A:正常對(duì)照;B:萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥 3 g·kg－1;C:雄黃 0.3 g·kg－1;D:亞砷酸鈉 0.036 g·kg－1;E:朱砂0.3 g·kg－1;F:氯化汞0.07 g·kg－1.Fig.1 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on pathological morphology in liver of mice(HE ×200).

圖2 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)小鼠腎損傷的病理影響(HE ×200).A:正常對(duì)照組;B:萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥 3 g·kg－1組;C:雄黃 0.3 g·kg－1組;D:亞砷酸鈉 0.036 g·kg－1組;E:朱砂0.3 g·kg－1組;F:氯化汞0.07 g·kg－1組.Fig.2 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on pathological morphology in kidneys of mice(HE ×200).

由圖2可見，正常對(duì)照組(圖2A)腎臟腎小球完整，腎小管清晰可見。與正常對(duì)照組相比，亞砷酸鈉組腎小球萎縮，間質(zhì)炎癥反應(yīng)(圖2D);氯化汞組腎小管管腔細(xì)胞腫脹，空泡變性，可見點(diǎn)狀細(xì)胞凋亡和壞死(圖2F)，而萬(wàn)勝化風(fēng)丹組(圖2B)、雄黃組(圖2E)、朱砂組(圖2C)病變輕微。

2.4 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)小鼠肝MT-1 mRNA表達(dá)的影響

由表4可知，減方藥組、亞砷酸鈉組及氯化汞組的肝MT-1 mRNA水平均顯著增高，分別為正常對(duì)照組的2倍、4倍和10倍(P＜0.01)。亞砷酸鈉組及氯化汞組的腎MT-1 mRNA水平均顯著增高，分別為正常對(duì)照組的3倍和7倍。亞砷酸鈉組(相當(dāng)于原方藥組含砷量的10%)，氯化汞組(相當(dāng)于原方藥組含汞量的20%)引起了肝腎應(yīng)激反應(yīng)。亞砷酸鈉應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)于雄黃，氯化汞也強(qiáng)于朱砂。

表4 萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥、減量方藥和減方藥對(duì)小鼠肝金屬硫蛋白(MT-1)mRNA表達(dá)的影響Tab.4 Effect of original Wansheng Huafeng Dan，the reduction recipe and the less prescriptions on expression of metallothionein 1(MT-1)mRNA in liver and kidneys of mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，萬(wàn)勝化風(fēng)丹減方藥，減量方藥，原方藥中雄黃、朱砂含量依次遞增，小鼠ig給予8 h后，砷汞在肝腎中蓄積量也依次增高，但是血清肝、腎生化指標(biāo)和病理均沒有明顯的改變，提示無明顯肝腎功能異常。雖然亞砷酸鈉組砷的攝入量只有萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥組的10%，卻引起了肝腎組織砷蓄積的顯著增高(5倍)，并且引起肝腎病理?yè)p傷和血清轉(zhuǎn)氨酶升高。氯化汞組大鼠汞的攝入量?jī)H為萬(wàn)勝化風(fēng)丹原方藥的20%，也引起了肝腎組織汞的顯著蓄積和肝、腎病理?yè)p傷及BUN升高，由此可知，亞砷酸鈉和氯化汞的毒性遠(yuǎn)大于雄黃和朱砂。萬(wàn)勝化風(fēng)丹3 g·kg－1用量相當(dāng)于臨床用量的7.5倍，在此劑量下，一次性給藥未見明顯肝腎毒性。砷毒性取決于其化學(xué)物結(jié)構(gòu)、氧化狀態(tài)和其代謝途徑，而不同砷化合物的毒性可相差百倍、甚至于千倍。如某些海鮮含砷量高于砒霜含砷量上千倍，但可食用［3］。金屬汞、無機(jī)汞和有機(jī)汞的毒性也不宜用總汞的含量來衡量，微量的二甲汞可致死，而大量的朱砂則不一定致死［4］。

一些研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中的藥物可以減少砷和汞從雄黃和朱砂釋放［7］，但本實(shí)驗(yàn)觀察到不同的結(jié)果。雄黃組雖然與原方藥組含砷相當(dāng)，但是雄黃組較原方藥組引起的肝和腎砷蓄積少，說明萬(wàn)勝化風(fēng)丹復(fù)方可以促進(jìn)雄黃中砷的生物利用度;朱砂組較原方藥組引起的肝汞蓄積少，但是較原方藥組腎汞蓄積量多，說明萬(wàn)勝化風(fēng)丹復(fù)方對(duì)朱砂中汞的釋放具有組織特異性。中藥配方有君、臣、左、使的關(guān)系，也說明砷、汞在一定劑量范圍內(nèi)，有特定的藥理作用，這亟待進(jìn)一步研究。

MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的內(nèi)臟器官中廣泛存在，尤以肝、腎細(xì)胞為主，并且參加其功能調(diào)節(jié)。MT的巰基能強(qiáng)烈螯合有毒金屬，從而實(shí)現(xiàn)解毒功能。MT通過與重金屬結(jié)合可以有效地減輕重金屬對(duì)機(jī)體的毒害，是對(duì)金屬暴露和隨之產(chǎn)生的毒性最敏感的生物標(biāo)志［2，10，16－18］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠染毒8 h后，MT mRNA升高是可以作為金屬暴露和毒性的生物標(biāo)志，而雄黃和朱砂對(duì) MT的誘導(dǎo)遠(yuǎn)低于常見的砷、汞化合物［16－17］。與萬(wàn)勝化風(fēng)丹一樣，急性給予六神丸、安宮牛黃丸及雄黃、朱砂后產(chǎn)生的砷、汞蓄積和肝、腎毒性均遠(yuǎn)低于亞砷酸鈉和氯化汞，說明雄黃和朱砂的毒性作用不能用亞砷酸鈉和氯化汞替代說明［16－17］。

砷毒性效應(yīng)的大小與攝入人體的劑量、時(shí)間及途徑有關(guān)，也與砷的價(jià)態(tài)有關(guān)。無機(jī)砷(3價(jià))化合物能與蛋白質(zhì)中的巰基作用，毒性較大，砷化合物毒性順序?yàn)?AsH3＞As3+＞ As0＞As5+＞ As4S4(雄黃)［3，6］。在本實(shí)驗(yàn)中，亞砷酸鈉引起了 ALT 的升高、肝腎病理?yè)p傷，而雄黃未見明顯毒性，這可能是因?yàn)閬喩樗徕c比雄黃更易進(jìn)入肝腎組織，所以其在組織中蓄積遠(yuǎn)高于雄黃。同樣，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，朱砂毒性遠(yuǎn)小于氯化汞，因?yàn)橹焐暗娜芙舛扰c生物利用度都很低，在20℃時(shí)，氯化汞在水中溶解度是30～70 g·L－1，而朱砂在水中溶解度只有 0.001 g·L－1［4］。小鼠一次口服染毒朱砂20 g·kg－1(約相當(dāng)于臨床劑量的250倍)未見死亡，而染毒甲基汞(MeHg)0.1 g·kg－1或氯化汞0.15 g·kg－1則致死［11］。此外，體外實(shí)驗(yàn)亦表明，雄黃和朱砂的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)小于亞砷酸鈉、砷酸鈉、氯化汞和甲基汞［11，18］。因此，砷和汞化合物的形式?jīng)Q定了其毒性。

由于國(guó)際上對(duì)砷和汞毒性的普遍關(guān)注，我國(guó)對(duì)《中國(guó)藥典》中的雄黃和朱砂劑量進(jìn)行過修訂，如1990年版及以往的歷版藥典雄黃、朱砂日用劑量較大，為0.3～1.5 g，1995年版藥典將雄黃和朱砂劑量降至0.1～0.5 g。然而這種劑量調(diào)整僅僅是出于對(duì)朱砂和雄黃毒性的擔(dān)憂，并沒有充分的科學(xué)依據(jù)［8］。含雄黃的牛黃解毒片復(fù)方對(duì)發(fā)熱模型大鼠炎癥介質(zhì)有抑制作用［7］。在病理狀態(tài)下(感染性腦水腫)安宮牛黃散可抑制被過度激活的乳酸脫氫酶［9］。還有研究表明，去除雄黃和朱砂的中藥復(fù)方藥效降低［12－15］，在腦出血大鼠模型，安宮牛黃丸全方(含雄黃和朱砂)可通過影響興奮性氨基酸的表達(dá)明顯降低腦組織的繼發(fā)性損害，去除雄黃和朱砂的減方藥作用不明顯［12］。在改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能障礙、降低腦系數(shù)和腦血腫、周圍腦組織含水量及提高紅細(xì)胞變形能力方面，全方藥也有優(yōu)于減方藥的趨勢(shì)［13］。最近研究表明，雄黃是安宮牛黃丸抗炎作用的有效組分之一［14－15］。雄黃和朱砂在萬(wàn)勝化風(fēng)丹中的確切藥理作用還有待進(jìn)一步研究。

劑量和用藥時(shí)間是藥物產(chǎn)生毒性的重要因素。雖然本研究表明萬(wàn)勝化風(fēng)丹的急性毒性遠(yuǎn)低于其他砷汞化合物，但是選擇藥物的適應(yīng)證依然很重要，因?yàn)椴煌±頎顟B(tài)對(duì)藥物反應(yīng)不一樣，應(yīng)合理用藥，不要長(zhǎng)期久服。比較長(zhǎng)期服用朱砂安神丸［2］和安宮牛黃丸［10］的慢性毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含雄黃和朱砂的中藥復(fù)方毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于亞砷酸鈉和氯化汞。

因此，用總砷、總汞來評(píng)價(jià)雄黃、朱砂的毒性缺乏科學(xué)可比性，應(yīng)考慮其毒代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)特征。

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