劉罡一,賈晶瑩,劉海明,陸 川,張夢琪,余 琛*

(1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,上海 200031;2.上海醫(yī)藥臨床研究中心分析化學(xué)部,上海 200233)

1 儀器和試藥

1.1 儀器 3200 Qtrap串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);液相色譜儀:包括 SIL-20ACH T自動進(jìn)樣器、LC-20AD輸液泵、DGU-20A3在線脫氣儀(日本島津公司);CP225D分析天平(德國Sartorius公司);Mikro冷凍高速離心機(jī)(德國Hettich公司);Vortex-2渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)。

1.2 藥品和試劑 加巴噴丁(純度≥98%,批號TRC-020031001,加拿大T RC公司),內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶(純度 99.7%,批號 1024X,美國Sigma公司);甲醇、乙腈、甲酸為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 XBridge Phenyl(150 mm×

2.1 mm,5 μ m)色譜柱(美國 Waters公司);流動相:0.02%甲酸的乙腈溶液-0.02%甲酸的水溶液(15∶85),流速:0.3 ml/min,柱溫:室溫,進(jìn)樣量:5 μ l。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子掃描;氣簾氣:30,碰撞氣:7,GS1:50,GS2:50,離子源電壓:5000 V,離子源溫度:550℃;多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描分析,加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶離子對分別為m/z 172→154.1和m/z 279→124。數(shù)據(jù)采集與處理采用Analyst 1.4.2軟件(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

2.3 質(zhì)譜分析 加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶在電噴霧離子化方式下,主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,分別為m/z 172和m/z 279。選擇性對上述離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,加巴噴丁的主要碎片離子為m/z 154.1(脫去一分子H2O),內(nèi)標(biāo)的主要碎片離子為m/z 124(脫二甲氨基嘧啶),并將其作為定量分析時監(jiān)測的產(chǎn)物離子。典型的碎片離子圖見圖1。

圖 1 加巴噴丁(A)及內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶(B)的質(zhì)譜圖Figure 1 The mass spectrum photograms of gabapentin(A)and internal standard sulphadimethyl iso-pyrimidine(B)

2.4 血清樣品處理 精密稱取加巴噴丁和磺胺二甲異嘧啶適量,分別加甲醇配制成濃度為1.0 mg/ml的加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液和0.9 mg/ml的磺胺二甲異嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取 100 μ l血清,加入濃度為900 ng/ml內(nèi)標(biāo)工作溶液 10 μ l,乙腈 200 μ l,渦旋30 s,室溫 1.5×104r/min(離心半徑 11 cm)離心2 min,吸取上清液作為進(jìn)樣液。

2.5 線性關(guān)系考察 在血清中依次加入加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成相當(dāng)于加巴噴丁血清濃度為50 、100 、250、1 250、2 500、5000 ng/ml的血清樣品,按2.4項(xiàng)下操作,取 5 μ l進(jìn)樣分析。以待測物濃度為x,待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y,其加權(quán)(1/x)線性回歸后,加巴噴丁的回歸方程為:Y=0.008463x-0.019 22(r=0.999 6)。結(jié)果表明,加巴噴丁在50～5000 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加巴噴丁的最低定量限為50 ng/ml(S/N＞10∶1)。

2.6 方法專一性 取6個不同來源人的空白血清,每個來源的空白血清分別配制成含加巴噴丁低、中濃度(150、2000 ng/ml)質(zhì)控血清樣品各3份和3份空白血清,共計(jì)54份樣品,按照2.4項(xiàng)下處理步驟操作并進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,內(nèi)源性物質(zhì)對加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)的測定無干擾(見圖2)。6個不同來源人血清低、中濃度質(zhì)控測定結(jié)果的準(zhǔn)確度均在91.8%～105.1%,RSD均＜6%,基質(zhì)對測定結(jié)果影響很小,方法專一性強(qiáng)。

圖2 人血清中加巴噴丁及內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶的HPLC譜圖Figure 2 HPLC photograms of gabapentin and internal standard sulphadimethyl iso-pyrimidine in human serum

2.7 提取回收率 測定低、中、高濃度(150、2000、4000 ng/ml)的質(zhì)控血清各6份,得到峰面積B1,另取空白血清按2.4項(xiàng)方法進(jìn)行處理,加入適量加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)的工作溶液,配制成與質(zhì)控血清理論進(jìn)樣濃度相同的溶液進(jìn)樣分析,得到峰面積B2;以B/B2的值計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明,加巴噴丁在低、中、高濃度和內(nèi)標(biāo)濃度為900 ng/ml時的提取回收率分別為 108.5%、97.7%、107.7%和109.9%,RSD%分別為 9.8%、3.3%、5.5%和11.5%。

2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取低、中、高濃度的質(zhì)控血清各6份,連續(xù)制備3批,按照2.4項(xiàng)下方法操作并進(jìn)樣分析,以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控血清樣品的濃度,計(jì)算相對回收率為92.4%～110.4%,批內(nèi)、批間RSD均＜10%(n=6)。

2.9 穩(wěn)定性考察 取低、中、高3種濃度的質(zhì)控血清樣品,按2.4項(xiàng)下方法處理后,分別在室溫下放置0、6、12和18 h時進(jìn)樣測定。樣品凍融穩(wěn)定性是將血清樣品置-20℃避光保存,然后在室溫下自然解凍,按2.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣,如此反復(fù)2次。結(jié)果表明,預(yù)處理好的血清質(zhì)控樣品在室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定,血清質(zhì)控樣品經(jīng)過2次凍融后仍穩(wěn)定,RSD均＜10%(n=3)。

3 討 論

國外有文獻(xiàn)報(bào)道用LC-MS/MS法[4]測定人血清中加巴噴丁含量,采用液液萃取法進(jìn)行樣品預(yù)處理,需要用氮?dú)獯蹈?過程繁瑣、耗時。本研究在該方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,采用乙腈直接沉淀蛋白質(zhì)進(jìn)行樣本處理,操作過程更加簡便。在摸索條件時發(fā)現(xiàn),在流動相中加入0.02%甲酸,能夠提高離子化效率,改善峰形,同時靈敏度也有所提高。

本研究建立的LC-MS/MS測定人血清中加巴噴丁含量的方法是本實(shí)驗(yàn)室抗精神類藥物和抗抑郁類藥物治療藥物監(jiān)測平臺的一部分,該平臺包括有32種藥物的監(jiān)測,根據(jù)臨床常用以及市場上能購買到的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤x擇藥物。在平臺開發(fā)后,作者也開展了一些治療藥物監(jiān)測以及生物利用度研究,但由于本院使用加巴噴丁的病人很少,所以沒有臨床樣本監(jiān)測。今后計(jì)劃與上海地區(qū)各家精神衛(wèi)生中心聯(lián)系,希望能獲得一些臨床樣本開展治療藥物監(jiān)測,檢驗(yàn)本方法的實(shí)用性。

[1] 龔志毅,葉鐵虎,郝絨絨,等.加巴噴丁治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛的有效性和安全性研究[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2008,14(2):72-77.Gong ZhiYi,Ye TieHu,Hao Rong Rong,et al.The efficacy and safety of gabapentin in postherpetic neuralgia[J].Chin J Pain Med,2008,14(2):72-77.Chinese with abstract in Enlish.

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