牛支原體肺炎流行RT-PCR方法的初步診斷

張永強，張 維，王清華，吳研功，趙云玲，趙永剛，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 國家外來動物疫病診斷中心，山東 青島 266032）

近年來，我國部分地區(qū)肉牛發(fā)生以壞死性肺炎為主要特征的呼吸道傳染病，病牛出現(xiàn)咳嗽，食欲不振，消瘦等癥狀，有的病牛出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎或腹瀉[1-2]。本實驗室對山東某一牛交易市場部分牛群進(jìn)行鼻腔棉拭子采樣，采用PCR方法對引起牛發(fā)生類似癥狀的主要支原體進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

64份鼻腔棉拭子樣品,采自山東某地一牛交易市場，該交易市場牛出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀為主的傳染性疫病。

1.2 酶、試劑和主要儀器

病毒RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶為羅氏公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體以及限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物公司；DNA純化試劑盒SpinPrep Gel DNA Kit為Novagen公司產(chǎn)品；其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 引物

根據(jù)NCBI上公布的支原體16S rRNA核酸序列，針對牛常見致病支原體，用Primer Premier 5.00軟件設(shè)計5對引物（表1）。

1.3.2 RNA提取

按羅氏公司RNA提取試劑盒進(jìn)行。

1.3.3 RT-PCR反應(yīng)

以上述提取的總RNA做模板，對牛羊主要致病性支原體檢測陽性的樣品，分別用引物P1、P2、P3、P4、P5進(jìn)行差異脲原體、牛支原體、牛生殖道支原體、牛眼支原體和絲狀支原體絲狀亞種（SC型）RT-PCR檢測，將擴增產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pMD18-T載體（寶生物工程大連有限公司），交由上海生工進(jìn)行序列測定。

RT-PCR 反應(yīng)體系為 25μL，模板 3μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，r-taq 0.6μL，HPR-I 0.5μL，MLV 0.25μL，上游引物（20 μ M）1μL，下游引物（20 μ M）1μL，Rnase free H2O 14.15μL。

反應(yīng)程序：首先42℃40 min；接著95℃變性3 min；然后 94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 牛支原體檢測結(jié)果

對牛羊主要致病性支原體檢測陽性的樣品，進(jìn)行牛支原體（P2）PCR 檢測，陽性樣品為 17、28、30、33、36、39、42（圖 1）。

2.2 其他支原體檢測結(jié)果

應(yīng)用引物P1、P3、P4、P5對待檢樣品進(jìn)行差異脲原體、牛生殖道支原體、牛眼支原體和絲狀支原體絲狀亞種（SC型）病原檢測，結(jié)果均為陰性。

2.3 序列比對結(jié)果

將牛支原體PCR陽性產(chǎn)物克隆到pMD18-T進(jìn)行測序并進(jìn)行序列分析，利用BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比較。結(jié)果顯示，與GenBank中牛支原體（Mycoplasma bovis）16SrRNA 序列（GenBank登錄號：AF332754）同源性為99%以上，因牛支原體屬于無乳支原體的一個亞種，因此與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae）也具有很高的同源性。對測序結(jié)果進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，相比無乳支原體而言，所測序列，與牛支原體有更近的遺傳距離（圖2）。說明引起本次部分牛發(fā)病的病原可能是牛支原體。

3 討論

牛支原體最早在1961年被鑒定為致乳腺炎的病原[4]，現(xiàn)在被認(rèn)為是育肥牛、青年奶牛與犢牛呼吸道疾病與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病因。牛支原體除了導(dǎo)致牛急性呼吸系統(tǒng)疾病外，還可導(dǎo)致持續(xù)性的慢性感染，以慢性支氣管炎伴有肺干酪樣或凝固性壞死病變?yōu)橹?。牛支原體常與細(xì)菌、病毒協(xié)同作用，環(huán)境因子如天氣、通風(fēng)不良、過度擁擠、運輸?shù)葘⒓觿〔∏閇5]。

患有牛支原體的病牛可通過鼻腔分泌物排出牛支原體，健康?？赏ㄟ^近距離接觸病牛而感染發(fā)病。牛支原體在環(huán)境中存活力差，但在無陽光情況下可存活數(shù)天，如4℃下可在海綿中或牛奶中存活2個月，或水中存活2周以上；20℃存活1～2周，或37℃存活1周。糞便中可存活37天[6]。常規(guī)消毒劑均可達(dá)到消毒目的。

本實驗設(shè)計多對引物，采樣PCR方法對臨床采集的棉拭子樣品進(jìn)行了牛支原體、差異脲原體、牛生殖道支原體、牛眼支原體和牛傳染性胸膜肺炎（CBPP）的病原學(xué)檢測，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將序列與NCBI上進(jìn)行比對證明所得序列與牛支原體和無乳支原體都具有很高的同源性。隨后，將所得序列與牛羊主要致病支原體進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，證明得到的核酸序列與牛支原體具有更近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，從而更加確鑿的證明了本次引起牛發(fā)病的病原是牛支原體。

[1]石磊，龔瑞，尹爭艷，等.肉牛傳染性支原體肺炎流行的診斷[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，27（5）：629-633.

[2]辛九慶.牛傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)與分子流行病學(xué)研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2007.

[3]陳繼明.重大動物疫病監(jiān)測指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008.

[4]HALE H H，HEMBOLDT C F，PLASTRIDGE W N.Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species[J].Cornell Veterinarian，1962，52：582-591.

[5]CASWELLJL，ARCHAMBAULTM.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle[J].Anim Health Rev，2007，8（2）：161-186.

[6]王桂芝.動物霉形體及研究方法 [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.