非洲豬瘟研究進展

王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266034）

非洲豬瘟（ASF）是由病毒（ASFV）引起的家豬和野豬的一種高度接觸性傳染病，所有品種和年齡的豬均易感。家豬感染后出現(xiàn)發(fā)熱、高病毒血癥和出血性病變等典型特征，發(fā)病率高，但死亡率因感染毒株和豬品種的不同而有所差異，從5%到100%不等。通常將臨床表現(xiàn)分為最急性、急性、亞急性和慢性四種類型，最急性和急性型病死率高，解剖病變與古典豬瘟類似，（但病程更短，盲腸結(jié)腸見不到潰瘍，脾臟見不到梗死）。不同種類的野豬感染后臨床表現(xiàn)差異很大，其中歐亞野豬、美洲野豬的臨床表現(xiàn)與家豬類似，而非洲的疣豬、叢林野豬等多呈陰性感染，北美的花斑野豬對本病具有抵抗力。目前，ASF診斷和檢測技術(shù)非常成熟，但疫苗研究卻一直未能成功，因此歷史上所有消滅非洲豬瘟的國家，都是通過及時準(zhǔn)確的診斷檢測和嚴(yán)格有效的封鎖撲殺等措施取得成功的。

1 流行病學(xué)

發(fā)病豬的血液和分泌物中含有大量病毒，鈍緣蜱屬的軟蜱可以感染、繁殖并傳播病毒，因而帶毒家豬、野豬和鈍緣蜱都是該病的宿主和傳染源。研究表明，鈍緣蜱屬的軟蜱，尤其是O.moubata、O.erraticus等鈍緣蜱，其壽命可長達20年之久，不僅可長期攜帶病毒，也可通過交配和卵傳遞病毒。ASFV主要通過消化道和鈍緣蜱叮咬感染，但在同一豬群內(nèi)也可通過呼吸道感染。ASFV可通過不同的方式進行傳播:遠離非洲且歷史上無疫情的國家多通過含ASFV的豬肉制品或運輸工具廢棄的殘羹傳入；接壤的國家還可以通過帶毒野豬的遷移傳入；此外有軟蜱存在的國家，病毒還能通過軟蜱與野豬（尤其是疣豬）之間的循環(huán)得以長期維持，并伺機傳染給家豬。一般情況下，直接接觸感染的潛伏期為5～15 d，而軟蜱叮咬感染的潛伏期在5 d之內(nèi)。

2 歷史分布

迄今，全球共有49個國家曾經(jīng)發(fā)生或仍有ASF流行，特別是近年來高加索地區(qū)疫情嚴(yán)峻，對我國構(gòu)成極大威脅。ASF疫情最早于20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)于肯尼亞，1921年，蒙哥馬利對歐洲家豬引入肯尼亞后的疫情發(fā)生情況進行了詳細描述，隨后許多非洲國家均有報道，而且至今仍在撒哈拉以南地區(qū)流行。1957年，ASF首次在非洲大陸以外的地區(qū)出現(xiàn)，葡萄牙里斯本機場附近的豬場因飼喂了來自安哥拉航班的泔水而暴發(fā)疫情，隨后西班牙（1960）、法國（1964）、意大利（1967）、前蘇聯(lián)（1977）、馬耳他（1978）、比利時（1985）、荷蘭（1986）等歐洲國家均有發(fā)生，雖然多數(shù)國家很快撲滅了疫情，但葡萄牙和西班牙的疫情卻長期存在，直到1994和1995年才真正消滅。意大利的撒丁島由于存在野豬感染和康復(fù)帶毒豬，從1978年首次傳入以來，疫情一直存在。美洲部分國家，如古巴（1971、1980）、巴西（1978）、多米尼加（1978）和海地（1979）等都曾發(fā)生過ASF疫情，但相繼撲滅。2007年，歐洲大陸出現(xiàn)第二次流行，疫情首先在格魯吉亞Poti港附近的農(nóng)場出現(xiàn)，隨后迅速傳至亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯聯(lián)邦等周邊國家。此次疫情的發(fā)生，可能與飼喂了國際貨輪上被ASFV污染了的肉品垃圾有關(guān)，目前仍呈擴大蔓延趨勢，已造成巨大損失。

3 病原研究

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬中的唯一成員。在形態(tài)上類似虹彩病毒，在基因組結(jié)構(gòu)復(fù)制方式上類似痘病毒，實際并不相同。完整的病毒顆粒直徑約200nm，具有復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，外被囊膜，內(nèi)有核衣殼，20面體對稱，六邊形外觀。病毒中部為高電子密度核心，直徑約80nm，由病毒基因組以及完成早期轉(zhuǎn)錄所必需的酶（如DNA依賴性RNA聚合酶、mRNA加帽酶、多腺苷酸聚合酶等）和一些DNA結(jié)合蛋白組成（如P14.5、P10等）；核心外圍是核心衣殼，由 P150、P37、P34、P14 等蛋白組成；其外側(cè)是源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)囊膜（含 P54、P32、P22、P12、CD2v等）和圍繞在內(nèi)囊膜周圍的病毒衣殼（含P72、P17等）；病毒在出芽時可獲得外囊膜（含P24、P12、CD2v、P54等）。病毒能誘導(dǎo)易感動物產(chǎn)生高滴度抗體，但不具備保護作用，僅具有診斷意義。多數(shù)毒株感染單核-巨噬細胞后具有紅血球吸附能力，可用玫瑰花環(huán)試驗證實。

3.1 病毒基因組

ASFV基因組為線狀雙股單分子DNA，全長約170～192kb。中部為中央保守區(qū)（C區(qū)），長度約125kb，該區(qū)域的一些基因（如P72基因）常作為ASFV基因分型的依據(jù)；C區(qū)還含有一個4 kb的中央可變區(qū)（CVR），位于 P72伴侶蛋白基因 B602L（9RL），在不同基因型或同一基因型的不同毒株之間都存在差異；C區(qū)兩測各有一個可變區(qū)，分別稱為VL（38～48 kb）和 VR（13～22 kb），含有 5個多基因家族（MGF），每個多基因家族都可發(fā)生缺失、增加、分化等變異，這在不同毒株之間差異很大，與病毒抗原變異、逃避宿主防御系統(tǒng)的機制有關(guān)；基因組的兩端為共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，均含有長度為2.1～2.5 kb的顛倒重復(fù)序列（TIR）。

3.2 病毒編碼蛋白

基因組編碼蛋白的數(shù)量因毒株不同而有所差異，一般為150～175種，分布在DNA兩條鏈上。有的基因是以多聚蛋白（如PP220、PP62等）的形式表達，經(jīng)翻譯后加工形成大小不等的多種蛋白分子。迄今，發(fā)現(xiàn)純化的病毒粒子中至少含有54種蛋白，而感染的巨噬細胞中至少有100種病毒相關(guān)蛋白，這些蛋白的功能包括形成病毒的結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)病毒感染、催化病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄以及逃避宿主防御系統(tǒng)等。其中至少有50種蛋白具有免疫原性，在自然感染過程中能誘生抗體，特別是細胞結(jié)合蛋白（如P72、P54和P12）以及病毒內(nèi)吞相關(guān)蛋白（如P32）等都具有很高的抗原性。雖然這些蛋白不足以誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)，但卻足以用于血清學(xué)診斷。

3.2.1 P72 又稱P73，分子量73.2 kD，位于細胞內(nèi)病毒粒子的表層，是由B646L基因編碼的主要衣殼蛋白，具有很高的保守性。B646L基因C-末端約478 bp的核酸片段常用于ASFV分子診斷、遺傳進化分析和基因型鑒別，利用該片段可將ASFV分成22個基因型，其中，2007年傳入高加索地區(qū)的ASFV毒株為基因II型。

P72產(chǎn)生于病毒感染的晚期，含有優(yōu)勢抗原決定簇，能誘生高滴度的特異性IgG抗體。由于P72保守性高、抗原性好且易于分離純化，目前已作為主要抗原用于ASFV-IgG抗體檢測。

3.2.2 P54 又稱 j13L，分子量 19.9 kD，由 E183L基因編碼，屬于I類膜蛋白，含半胱氨酸殘基，分子間以二硫鍵相連形成二聚體，存在于病毒的內(nèi)外囊膜上。在感染細胞過程中，P54蛋白能與胞質(zhì)動力蛋白輕鏈LC8直接結(jié)合，從而促進病毒與宿主細胞的吸附和侵入。體外實驗中，純化的P54蛋白或其抗體能阻斷病毒與易感細胞的結(jié)合，但活體試驗并不明顯。在感染細胞內(nèi)，P54通過N末端跨膜區(qū)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，通過收斂作用，促進病毒囊膜前體的形成，因此是病毒復(fù)制的必需蛋白。

由于P54是一種抗原性強的膜結(jié)合蛋白，病毒感染后能產(chǎn)生針對P54的高滴度的IgG和IgM抗體，用P54蛋白建立的ELISA抗體檢測方法，具有很高的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，與OIE全病毒抗原ELISA水平相當(dāng)，用弱毒攻毒后7～10 d即可檢測到抗體，而且其制備過程不需要高的生物安全條件，因此是目前綜合評價最好的ELISA診斷抗原。

3.2.3 P32 又稱P30，分子量23.6kD，由CP204L基因編碼，是一種磷蛋白，與病毒侵入有關(guān)。P32含有優(yōu)勢抗原決定簇，能誘導(dǎo)較強的體液免疫應(yīng)答，而且，P32能在病毒感染的早期進行表達和分泌，產(chǎn)生抗體較早，因此，基于P32的ELISA常用于非洲豬瘟感染的早期診斷。

3.2.4 PP62 又稱PP60或P60，是一種多聚蛋白，分子量60.5 kD，由CP530R基因編碼，在病毒復(fù)制晚期表達，經(jīng)病毒編碼的SUMO樣蛋白酶裂解形成P35和P15兩種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，這一過程是在感染細胞內(nèi)的病毒工廠中完成的。有研究表明，PP62抗體檢測ELISA，具有很高的敏感性。

3.2.5 PP220 又稱P220，也是一種多聚蛋白，分子量281.5 kD，由CP2475L基因編碼，晚期表達，經(jīng)SUMO樣蛋白酶裂解生成P150、P37、P34和P14，這4種蛋白約占ASFV蛋白總量的25%，是構(gòu)成核心殼的主要成分，在病毒形態(tài)形成過程中起著重要作用。

3.2.6 其它蛋白 P12由O61R基因編碼，具有細胞吸附功能；S273R基因編碼SUMO樣蛋白酶，能水解多聚蛋白；CD2v由EP402R基因編碼，類似CD2，能使感染細胞具有紅血球吸附特性，是ASFV惟一的糖蛋白；B602L（又稱9RL）為P72伴侶蛋白，協(xié)助完成病毒衣殼的組裝；P14.5為DNA結(jié)合蛋白，在病毒粒子向胞漿膜遷移過程中發(fā)揮作用。ASFV還象痘病毒一樣，編碼胸苷激酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、RNA聚合酶、解旋酶等大量完成復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的酶類，此外，還有許多蛋白的生物學(xué)和免疫學(xué)功能目前尚不清楚。

3.3 病毒分型

ASFV血清中和試驗結(jié)果很不確實，因此血清分型難以進行，也無實際意義。在病原分子流行病學(xué)調(diào)查研究中，多采用P72基因序列分析的方法進行基因分型，迄今全球流行的ASFV毒株可分為22個基因型，其大致分布見圖2。

3.4 抵抗力

ASFV非常穩(wěn)定，對熱、腐敗、酸堿和蛋白酶均具有較高耐受性。在有血清介質(zhì)的情況下存活時間:5℃為6年，室溫為18個月，37℃為1個月，56℃為3.5 h。對pH變化抵抗力強，一般在無血清條件下，在pH3.9～11.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，pH13.4時仍能存活21 h；在有血清條件下抵抗力更強，pH3.1存活22 h，pH3.9存活3 d，pH13.4存活7 d。室溫條件下，在糞便中可存活11 d，腐敗血液中15 w；4℃條件下，在血液中存活18個月；在腌制干火腿中可存活150 d；在半熟肉以及泔水中也可長時間存活。

ASFV對乙醚和氯仿等脂溶劑敏感，消毒劑中季銨鹽、碘制劑和苯酚類效果較好，而0.8%NaOH、含2.3%有效氯的次氯酸鹽、0.3%福爾馬林以及3%鄰苯基苯酚均可在30min鐘內(nèi)滅活。

3.5 培養(yǎng)特性

ASFV可在豬單核巨噬細胞、骨髓細胞和白細胞中生長，可從豬血分離白細胞、仔豬骨髓中分離骨髓細胞、豬肺中分離巨噬細胞用于病毒分離培養(yǎng)；某些毒株經(jīng)適應(yīng)后也可在MS（Monkey stable，猴穩(wěn)定細胞系）、Vero、豬腎、牛腎等細胞以及雞胚中生長；有的實驗室還采用軟蜱進行病毒的傳代培養(yǎng)。

多數(shù)毒株感染白細胞后1～3 d出現(xiàn)病變，并能吸附豬的紅血球，可通過紅血球吸附試驗（HAD）加以證實。傳代細胞適應(yīng)毒引起的細胞病變更加明顯，在胞漿中可見包涵體，細胞容易脫落，可用熒光抗體或PCR方法等方法檢測細胞中的病毒。

4 感染與免疫

4.1 感染發(fā)病機制

ASFV對單核巨噬細胞具有明顯的親和力，病毒以不同方式進入機體后，可直接或通過血液循環(huán)感染局部淋巴組織中的單核巨噬細胞，大量增殖后，再次進入血液，吸附于紅細胞等血細胞，隨血液循環(huán)感染更多部位的單核巨噬細胞，稍后可進一步感染內(nèi)皮細胞、巨核細胞、中性細胞和肝細胞等多種細胞類型。同其它出血熱病毒一樣，ASFV可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞凋亡，使血管通透性增加，從而引起廣泛的出血性病變，在感染后期，則進一步發(fā)展成彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC），抗體與細胞成分的免疫復(fù)合物可能在這一過程發(fā)揮作用。在淋巴組織中，ASFV強毒株能導(dǎo)致大量的淋巴細胞凋亡，由于病毒不能直接感染T和B淋巴細胞，推測這種凋亡是由病毒感染的巨噬細胞表面或釋放的細胞因子引起的，并最終導(dǎo)致T和B細胞數(shù)量顯著減少，從而對ASFV免疫應(yīng)答受到損傷。

多數(shù)ASFV分離株能使家豬發(fā)生急性出血熱，感染后8～14 d，致死率可高達100%，某些中等毒力的毒株，致死率會降低至30%～50%，而伊比利亞半島分離的弱毒株，癥狀輕微，致死率很低。強毒或中等毒感染后，豬血毒滴度可達到每毫升108個半數(shù)紅細胞吸附單位（即108HAD50/mL），但康復(fù)之后血毒水平較低，病毒在組織中復(fù)制也顯著減少。新生仔豬人工感染表明，最早于感染后8 h即可出現(xiàn)初次病毒血癥，15～24 h出現(xiàn)第二次病毒血癥，30 h幾乎所有組織均可測到病毒，72 h即可達到最高滴度。弱毒感染后，雖然在淋巴組織中可檢測到中等水平的病毒滴度，但血毒滴度很低且僅能從少數(shù)豬中檢出?？祻?fù)豬能長期、持續(xù)帶毒，這一特性說明ASFV能有效地逃避宿主防御系統(tǒng)。

4.2 免疫應(yīng)答

感染ASFV強毒的豬多在出現(xiàn)體液免疫應(yīng)答之前就已死亡，存活時間稍長的豬則可出現(xiàn)特異性體液和細胞免疫應(yīng)答，康復(fù)豬對同源毒株的攻擊能產(chǎn)生較強保護力，但對異源毒株卻沒有抵抗力。早期研究表明，用弱毒株進行攻毒，1周后部分豬血清中出現(xiàn)補體結(jié)合（CF）抗體，2周后多數(shù)豬CF抗體陽性，部分豬開始出現(xiàn)瓊擴（AGP）抗體，3周后所有豬CF和AGP抗體陽性，可維持?jǐn)?shù)月以上。用ELISA試劑盒，多數(shù)在感染后7～10 d即可檢測到抗體，而且由于持續(xù)感染的存在，抗體可持續(xù)終生。

ASFV不能使機體產(chǎn)生具有保護作用的中和抗體，體外中和試驗也大都得出同樣結(jié)論；另一方面，該病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性細胞免疫應(yīng)答，僅能提供部分但并不充分的免疫保護。有研究者認(rèn)為耐過病豬能夠抵抗同源毒株的攻擊，是由于產(chǎn)生了干擾物質(zhì)的緣故。

5 診斷試劑與疫苗研究

由于目前尚無有效的疫苗，所有ASF的控制和消滅措施，均基于快速準(zhǔn)確的診斷。ASF診斷方法有很多，包括病原分離、紅細胞吸附試驗、PCR檢測、補體結(jié)合反應(yīng)、瓊脂擴散試驗、ELISA、免疫印跡（IB）、免疫熒光（IF）等。

5.1 診斷試劑

5.1.1 診斷抗原 可采用基因表達的方法制備抗原，也可采用病毒的細胞培養(yǎng)物制備抗原。

基因表達抗原，如 P72、P54、P32、PP62、A104R、B602L、K205R等，均被用于ELISA抗體檢測試劑的開發(fā)，其中P72、P54等應(yīng)用較廣，如西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的ASFV抗體阻斷ELISA試劑盒和雙抗夾心ELISA試劑盒，均以P72表達抗原及其單抗為基礎(chǔ)，分別用于抗體和病原檢測。

全病毒抗原，采用ASFV弱毒株感染MS等傳代細胞系制備，是目前OIE推薦的抗原制備方法，可廣泛用于ELISA、免疫印跡和瓊擴試驗等。

5.1.2 診斷抗體

陽性血清 可采用ASF康復(fù)豬血清制備，也可采用攻毒的方法制備。后者需在ABSL-3實驗室中進行，一般先用高滴度的弱毒株肌肉注射攻毒，再用低滴度的強毒株攻毒，根據(jù)需要可重復(fù)攻毒，最后一次攻毒后10 d，采血分離血清，56℃30min滅能，經(jīng)相應(yīng)方法（如 ELISA、CF、AGP等）標(biāo)定后，小量分裝，-20℃保存。

單抗 ASFV多種蛋白的單抗已研制成功，有的已用于診斷，如INGENASA夾心ELISA、阻斷ELISA等均以P72不同表位單抗作為捕獲或指示抗體。

5.1.3 抗原檢測ELISA 以單抗為基礎(chǔ)的夾心ELISA，可用于ASFV抗原檢測，特異性較高。INGENASA夾心ELISA試劑盒，以包被的P72（P73）單抗吸附樣品中的病毒抗原，用針對P72另一表位酶標(biāo)單抗顯示抗原的存在，可用于檢測血液、脾臟或淋巴結(jié)中的病毒抗原。

5.1.4 抗體檢測ELISA（OIE國際貿(mào)易指定試驗）

間接ELISA 該方法以全病毒抗原或表達抗原（如P72，P54等）包板，借以吸附血清中的ASFV抗體，然后以酶標(biāo)SPA（或抗豬IgG）指示抗體的存在，陽性樣品有顏色反應(yīng)。

阻斷ELISA 包被抗原同間接ELISA，指示抗體采用針對某一蛋白（如P72）的酶標(biāo)單抗，如果血清中有ASFV抗體，則單抗與包被抗原結(jié)合受阻，可根據(jù)OD值計算阻斷率，從而估計陽性值的高低，強陽性樣品無顏色反應(yīng)。

5.1.5 PCR檢測（OIE國際貿(mào)易指定試驗）

普通PCR根據(jù)ASFV分離株BA71V之P72基因保守序列設(shè)計引物，擴增基因組第88363～88619位核苷酸片段，總長度257 bp，該引物既可單獨用于ASFV核酸檢測，也可與豬瘟病毒引物混合用于鑒別診斷。

熒光定量PCR根據(jù)ASFV分離株BA71V之P72基因第2041～2290位核苷酸序列設(shè)計引物和探針，擴增長度250 bp，該方法比普通PCR敏感性更高。

5.2 疫苗與展望

迄今，所有疫苗的嘗試均沒有成功。這是由病原多變、主要侵害免疫屏障、容易逃避免疫系統(tǒng)、不能誘生有效中和抗體、涉及復(fù)雜的細胞免疫以及動物宿主本身的遺傳特性等多種因素決定的。

早期疫苗的研究主要集中在滅活疫苗和弱毒疫苗。大量研究表明，滅活疫苗雖然能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，但幾乎沒有保護作用。弱毒疫苗雖然對同源強毒有一定保護效果，但由于ASFV的高度變異性，其安全性很差，時常引發(fā)疾病，導(dǎo)致病原嚴(yán)重擴散。西班牙和葡萄牙在ASF傳入的早期曾嘗試使用弱毒疫苗，但最終均以失敗而告終，弱毒疫苗的使用導(dǎo)致了疫病大面積、長時間流行，嚴(yán)重影響了疫病控制和消滅的進程。

近20年來，運用分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)對ASF的疫苗和免疫問題也進行了諸多探索性研究。ASFV在吸附和進入細胞過程中，有P30、P54、P72等多種病毒蛋白參與，因此ASF亞單位疫苗和重組疫苗的研究大多傾向選取這些基因，但用桿狀病毒等表達系統(tǒng)研制的亞單位疫苗，僅能延緩臨床癥狀出現(xiàn)的時間并在一定程度上降低病毒血癥水平，卻并不能產(chǎn)生足夠的保護。

雖然如此，基于弱毒株或重組病毒等所進行的基礎(chǔ)研究，對未來ASF疫苗的研究策略仍具有一定的啟發(fā)意義。研究發(fā)現(xiàn)，ASFV弱毒株感染機體所產(chǎn)生的特異性CD8+CTL，能識別巨噬細胞被ASFV強毒感染后所形成的SLA I類分子-抗原復(fù)合物，引發(fā)這些巨噬細胞的凋亡；研究還發(fā)現(xiàn)，弱毒株的保護作用還與機體產(chǎn)生的NK細胞活性水平成正相關(guān)，也與巨噬細胞感染病毒后所釋放的細胞因子有關(guān)。這些證據(jù)表明，弱毒疫苗的保護作用可能主要由細胞免疫來完成。因此，未來ASF疫苗的研究，應(yīng)致力于研制能有效刺激保護性細胞免疫的安全疫苗，如重組偽狂犬病毒疫苗、毒力基因缺失疫苗、具備刺激細胞免疫能力的多肽疫苗等。由于ASFV是一種能發(fā)生高度變異的大病毒，存在著許多逃避宿主免疫系統(tǒng)的復(fù)雜機制，加上病毒感染、致病和免疫過程牽扯到許多成分和表位，近期在疫苗研究上取得突破仍很困難，只有通過基礎(chǔ)研究的不斷深入以及對病毒特性的不斷了解，才有可能找到新的思路。

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