HPLC法測定多聚甲醛牙髓失活劑中鹽酸可卡因含量

林瑤，楊敏茹，郭飛燕，王榮，王曉娟#a，顧宜#b（.第四軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院藥劑科，西安市 7003；.陜西省新藥評審中心，西安市 70065）

鹽酸可卡因為局部麻醉藥，具有麻醉止痛作用，應用廣泛，是常用牙髓失活劑的主要成分，但同時也是一種具有成癮作用的毒品。多聚甲醛牙髓失活劑主要有效成分為多聚甲醛和鹽酸可卡因，具有破壞牙髓神經(jīng)纖維素及髓鞘，使牙髓細胞壞死和止痛防腐等作用。其與砷失活劑相比，毒副作用小，制劑中鹽酸可卡因每次使用量約1.5mg，且在牙髓失活后由操作醫(yī)師取出，無成癮性，臨床使用多年，安全、方便，作為醫(yī)院標準制劑收載于《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）[1]中。該制劑原質(zhì)量標準中采用分光光度法測定鹽酸可卡因含量，但因該制劑基質(zhì)復雜，萃取步驟多，導致測定結(jié)果不穩(wěn)定。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，保證用藥安全，本文采用高效液相色譜（HPLC）法測定鹽酸可卡因的含量，結(jié)果表明，所建立的方法簡便、靈敏、快速，結(jié)果準確、可靠。

1 儀器與試藥

LC-2010A HT HPLC儀、UV-VIS檢測器、LC-solution工作站（日本島津公司）；A210P電子天平（德國Sartorius公司）。

多聚甲醛牙髓失活劑（第四軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院制，批號:100301、100402、100709，鹽酸可卡因含量:7%）；鹽酸可卡因?qū)φ掌罚ㄇ嗪Ｖ扑帍S有限公司，批號:20090401，含量:99.8%）；甲醇為色譜純，水為純化水，三乙胺、磷酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相:甲醇-0.5%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH值至4.5）＝30∶70；檢測波長:235 nm；流速:1.0mL·min－1；柱溫:25 ℃；進樣量:10 μL。取“2.2”項下對照品、供試品和空白溶液進樣分析，結(jié)果，鹽酸可卡因在上述色譜條件下能有效分離，理論板數(shù)大于3000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.空白；1.鹽酸可卡因Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test samples；C.blank sample；1.cocaine hydrochloride

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液。精密稱定干燥至恒重的鹽酸可卡因?qū)φ掌?0.26mg，加甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，制成濃度為405.2μg·mL－1的鹽酸可卡因?qū)φ掌焚A備液。精密量取該貯備液10mL至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為81.04 μg·mL－1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液。取本品約0.3 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加甲醇溶解，過濾至50mL容量瓶中，加甲醇沖洗濾渣及錐形瓶，洗液濾過并入錐形瓶中，加甲醇至刻度，精密量取10mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 空白溶液。根據(jù)該制劑處方制備不含鹽酸可卡因的空白樣品，按“2.2.2”項下方法制備空白溶液。

2.3 線性關系考察

分別精密量取對照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL，置于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進樣10μL，按“2.1”項下色譜條件測定鹽酸可卡因峰面積，以鹽酸可卡因濃度（c）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程A＝23006c+418.4（r＝0.9997）。結(jié)果表明，鹽酸可卡因檢測濃度線性范圍為16.208～129.664μg·mL－1。

2.4 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品溶液10μL，重復進樣6次，測得鹽酸可卡因峰面積的RSD為1.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.2”項下制備的對照品溶液及供試品溶液，各進樣10 μL，考察其在0、2、4、8、12、24h內(nèi)的穩(wěn)定性，各進樣6次。結(jié)果對照品峰面積的RSD為1.58%，供試品峰面積的RSD為1.18%（n＝6），表明對照品和供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取樣品（批號:100709）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10μL。計算得鹽酸可卡因的平均含量為7.003%，RSD為1.36%（n＝6），表明此方法重復性好。

2.7 加樣回收率試驗[2]

精密稱定本品0.3 g，置于錐形瓶中，分別精密加入相當于所稱樣品中鹽酸可卡因理論含量（經(jīng)測定，批號為100709的樣品中鹽酸可卡因含量為7.003%）80%、100%、120%的鹽酸可卡因?qū)φ掌?，每個濃度制樣3份，共9份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣、測定，計算回收率及RSD，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.8 樣品含量測定

取3批多聚甲醛牙髓失活劑樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣10μL測定，記錄色譜，按外標法計算含量。結(jié)果，3批樣品中鹽酸可卡因含量分別為7.164%、7.029%、7.011%（分別為標示量的102.34%、100.41%、100.16%），平均含量為7.068%（為標示量的100.97%）。

3 討論

鹽酸可卡因的測定方法有非水滴定法、間接原子吸收分光光度法、旋光法、毛細管區(qū)帶電泳法、三階倒數(shù)光譜法、一階導數(shù)光譜法等[3～8]。因上述方法操作復雜，計算方法煩瑣，本文選擇操作過程簡便、直觀、快捷的HPLC法測定制劑中鹽酸可卡因含量。根據(jù)文獻[9]，鹽酸可卡因在235 nm波長處有較大吸收，經(jīng)測定在該波長下鹽酸可卡因檢測靈敏度高，故選擇235 nm為檢測波長。該文獻應用流動相0.04 mol·L－1磷酸鹽緩沖液（含有0.26mmol·L－1四丁基銨鹽，pH3.2）-乙腈＝83∶17測定動物血清中可卡因的含量。另有文獻[10]采用流動相為乙腈-0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液（用0.1 mol·L－1氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至4.6）＝40∶60，測定可卡因類似物鹽酸辛可卡因的含量。筆者試用上述流動相，但即使調(diào)整各流動相組分比例，效果也均不是很理想，且成本較高?？紤]到可卡因為含氮堿性化合物，在流動相中添加掃尾劑三乙胺可改善峰形，經(jīng)試驗不同比例三乙胺和pH值，最終采用甲醇-0.5%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH值至4.5）＝30∶70作為流動相，結(jié)果所得峰形、理論板數(shù)、分離度等均較好。試驗中發(fā)現(xiàn)，制備對照品、供試品溶液，用水為溶劑時穩(wěn)定性不好，溶液放置8 h濃度下降約8%。考慮到鹽酸可卡因在甲醇中溶解度也較好，因此采用甲醇作溶劑，以克服溶液穩(wěn)定性差的問題。另外，試驗中發(fā)現(xiàn)，進樣量大于12μL時，峰形開始變差，進樣量為20μL時，峰形難以確認，但原因不明，因此，本文試驗選用進樣量為10μL。

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