曹亞彬，奚新偉，吳皓瓊，郭立姝，牛彥波，殷 博

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

自上世紀(jì)50年代，我國的科技工作者就開展了加菌溫水漚麻方面的研究與應(yīng)用工作，隨后進行的工作對技術(shù)進行了補充和創(chuàng)新，高性能的菌株不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用效果不斷提高?，F(xiàn)有的研究報道中，使用的菌株集中在芽孢桿菌屬，分別使用了厭氧芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、費氏芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。在使用效果上達到了縮短漚麻周期、提高出麻率、改善纖維質(zhì)量及減少污水排放等目的。加菌溫水漚麻技術(shù)能夠解決亞麻原料企業(yè)生產(chǎn)中的實際問題，但菌劑的高成本也是限制該項技術(shù)應(yīng)用的因素之一。在本文中，以降低生產(chǎn)成本為目的，研究了適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方組成和培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料：本單位分離保藏的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HW201，化學(xué)試劑為分析純，玉米面、豆粕粉市場采購，生產(chǎn)試驗用磷酸氫二鉀、碳酸鈣為市場采購的工業(yè)產(chǎn)品。

1.2 測定方法：菌體計數(shù)采用平板計數(shù)法[1]；使用數(shù)顯型酸度計PHS-3C直接測定培養(yǎng)液的pH；采用DNS比色法測定總糖[2]。

1.3 芽孢率測定方法：待測樣品1.0mL，加入到9mL的90℃以上水中，迅速混勻后加入到沸水浴中處理10min，取出迅速冷卻到室溫。以此為基礎(chǔ)樣本進行平板培養(yǎng)計數(shù)，統(tǒng)計代表樣品中芽孢數(shù)量。以未經(jīng)熱處理的原始樣品為對照測定菌體總數(shù)，兩者的百分比為芽孢率。

1.4 雜菌率測定方法：在平板培養(yǎng)基上生長的非目的菌落，視為雜菌，雜菌占菌落總數(shù)的百分比即為雜菌率。

1.5 培養(yǎng)基優(yōu)選試驗[3]：依據(jù)34正交表中的要求配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基100mL裝入250mL三角瓶中，1.0kgf/cm2壓力下滅菌。接種枯草芽孢桿菌HW201菌懸液1.0mL，搖床120r/min、32℃下培養(yǎng)48hr。試驗數(shù)據(jù)利用Latin統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。

1.6 生產(chǎn)試驗：在黑龍江省生物技術(shù)工程中心的2m3和5m3的發(fā)酵設(shè)備中進行。以玉米面1.5%，豆粕粉1.5%，磷酸氫二鉀0.4%，碳酸鈣0.4%和適量的消泡劑組成生產(chǎn)用培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度32±1℃、通風(fēng)量 1：0.8、時間 60hr。

1.7 固體菌劑制備：以液體方式生產(chǎn)的菌液，以2.5：1的固液比，用80目稻殼粉吸附，60℃低溫烘干24hr后備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基組成優(yōu)選

2.2 培養(yǎng)條件

表1 正交表的試驗設(shè)計（水：100mL）Table 1 The orthogonal experimental design（water：1000mL）

表1 正交表的試驗設(shè)計（水：100mL）Table 1 The orthogonal experimental design（water：1000mL）

表中試驗結(jié)果為三次測定結(jié)果的平均值；培養(yǎng)條件：31±1℃，250mL三角瓶裝量100mL，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，48hr。

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以正交試驗得到的最佳培養(yǎng)基進行培養(yǎng)條件試驗，具體的培養(yǎng)條件根據(jù)試驗要求進行調(diào)整，試驗的結(jié)果列于圖2。試驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌HW201的最佳培養(yǎng)溫度36℃，在30～38℃之間生長良好，在26℃時也有一定的生長能力；枯草芽孢桿菌HW201適宜在中性（pH6.5～7.5）條件下生長，超出此范圍生長受到明顯影響，相比較而言，堿性條件的影響較弱。對搖床轉(zhuǎn)速的試驗結(jié)果表明，隨轉(zhuǎn)速的提高，菌體濃度呈上升趨勢，說明增加通氣提高培養(yǎng)基中氧含量有利于菌體的生長，總體上分析，轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響小于溫度和pH。培養(yǎng)過程中菌體數(shù)量、pH、總糖的變化列于圖3中，在培養(yǎng)過程中，隨菌體數(shù)量的生長，總糖不斷下降，在48hr后兩者達到穩(wěn)定，菌體數(shù)量達到1014個/mL以上。培養(yǎng)液顏色在36hr～48hr內(nèi)開始出現(xiàn)變化，逐漸由黃、青、青灰、灰褐至黑褐色。由于培養(yǎng)基中使用碳酸鈣作為pH緩沖劑，培養(yǎng)過程中pH比較平穩(wěn)，保證了菌體在適宜的pH下快速生長。

圖1 單因子直觀分析Figure 1 The visual analysis ofsingle factor

圖2 枯草芽孢桿菌HW201的培養(yǎng)條件Figure 2 The culture condition ofBacillus subtilis HW201

圖3 枯草芽孢桿菌HW201培養(yǎng)過程中成分變化Figure 3 The changes ofcomponents in the trainingprocess for Bacillus subtilis HW201

2.3 生產(chǎn)試驗結(jié)果

以玉米面1.5%，豆粕粉1.5%，磷酸氫二鉀0.4%，碳酸鈣0.4%和適量的消泡劑組成生產(chǎn)用培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)條件為溫度32±1℃、通風(fēng)量1：0.8，分別在2m3和5m3的發(fā)酵罐中進行生產(chǎn)試驗（表2）。菌體生長在24hr后進入旺盛生長期，培養(yǎng)進行到48hr時進入穩(wěn)定生長期，菌體濃度分別達到1.1×1014cfu/mL和2.3×1014cfu/mL，芽孢率分別為12.4%和10.1%；在60hr培養(yǎng)結(jié)束，芽孢率分別達到22.3%和21.5%，菌體的濃度分別達到2.4×1014cfu/mL與4.8×1014cfu/mL。在產(chǎn)品分裝后的液體貯存過程中，菌體濃度在15d內(nèi)迅速下降，由2.4×1014cfu/mL下降到7.6×1011cfu/mL，芽孢率迅速上升，由22.3%上升到64.6%，也開始出現(xiàn)輕微的污染，雜菌率為1.37%。此后菌液保存到30d時，菌體濃度、芽孢率變化不大，雜菌率顯著上升達到7.33%。發(fā)酵罐生產(chǎn)出的菌液以2.5：1的固液比，用80目稻殼粉吸附，60℃低溫烘干24hr后，水分降低到4.3%。以此作為固體菌劑進行貯存試驗，初始固體菌劑的菌體數(shù)量達到8.4×1013cfu/g，芽孢率達到86.4%；在貯存過程中，菌體數(shù)量呈下降趨勢，芽孢率呈上升趨勢，但幅度不大；在試驗的過程中無雜菌污染發(fā)生。兩種菌劑相比，固體菌劑有明顯的優(yōu)勢，有利于菌體的貯存和使用。

表2 枯草芽孢桿菌HW201生產(chǎn)試驗培養(yǎng)結(jié)果Table 2 The culture result ofproduction test for Bacillus subtilis HW201

表3 枯草芽孢桿菌HW201菌劑貯存試驗Table 3 The preservation test for the agent ofBacillus subtilis HW201

3 討 論

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是比較常見的微生物菌群，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有較多應(yīng)用，對該屬微生物的研究很深入。本文研究的用于漚麻的枯草芽孢桿菌，在培養(yǎng)方式上與其他的芽孢桿菌基本一致，無特殊的營養(yǎng)要求，可以用常規(guī)的發(fā)酵技術(shù)和低成本的培養(yǎng)基對其進行大規(guī)模的培養(yǎng)。在貯存過程中，液體中菌體出現(xiàn)大量的死亡，數(shù)量急劇下降，其原因是⑴密閉包裝造成的厭氧環(huán)境，不適合這種芽孢桿菌的生長，出現(xiàn)生理性死亡；⑵在液體條件下有利于各種自溶酶發(fā)揮作用，不利于菌體的休眠，加速了菌體的死亡速度。而固體菌劑中的菌體處于休眠狀態(tài)，有利于產(chǎn)品保存，對整體技術(shù)的推廣使用有重要作用。

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