鄭 剛，駱文靜，陳耀明，劉明朝，馬金龍，陳景元

(第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系勞動與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

應(yīng)激對大腦功能的影響是神經(jīng)科學(xué)和心理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。較多的研究證實(shí)，當(dāng)人或動物處于強(qiáng)烈的急性應(yīng)激或長期慢性應(yīng)激的狀態(tài)時(shí)，其大腦功能(如學(xué)習(xí)記憶等)可受到明顯的損害[1，2]。目前的研究大多采用單一的應(yīng)激原進(jìn)行刺激，如束縛、足電擊等。但在實(shí)際情況下，應(yīng)激原通常是復(fù)合存在的。有關(guān)復(fù)合應(yīng)激原影響大腦學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制的研究目前還較少。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大腦皮質(zhì)、海馬是與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)。本實(shí)驗(yàn)建立慢性復(fù)合應(yīng)激大鼠模型，觀察應(yīng)激對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，以及應(yīng)激反應(yīng)過程中海馬、前額皮質(zhì)組織中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)表達(dá)的變化，探討慢性復(fù)合應(yīng)激對學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

成年雄性SD大鼠90只，體重 200～250g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。首先將大鼠在動物飼養(yǎng)室中適應(yīng)1周，室溫(23±1)℃，相對濕度50%，自然光照，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食飲水。將大鼠隨機(jī)分為對照組(n=18)和應(yīng)激組(n=72)。

1.2 應(yīng)激方法

慢性復(fù)合應(yīng)激方法:分別采用低溫暴露(-15℃，3 h/d)、噪聲(20Hz-20kHz，30min/d)、足電擊(45 V ，1 s/pulse，間隔 5 s，30min/d)、束縛(2 h/d)、尾部懸吊(3h/d)、睡眠剝奪(24h/d)、振蕩(水平振蕩頻率120b/min，10min/d)等7種方式，按照上述順序每天采用一種方法對大鼠進(jìn)行應(yīng)激刺激。應(yīng)激組大鼠平均分為4組 ，每組 18只，分別接受 1、2、3、4 周的應(yīng)激刺激。

1.3 學(xué)習(xí)記憶功能觀察

Morris水迷宮直徑120cm，深40cm，水深25 cm，平臺高23 cm，平臺直徑10cm;水溫23℃±2℃，在水中加入適量奶粉使之不透明。將平臺置于迷宮某一象限對角線中點(diǎn)處并在整個訓(xùn)練過程中保持不變，連續(xù)3 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。每只大鼠每天連續(xù)接受8次訓(xùn)練，方法為將大鼠依次從4個象限，面向池壁放入水中，每次訓(xùn)練搜索時(shí)間為60s。大鼠每次找到平臺后，使之在平臺上停留20s;若超過60s未能找到平臺者，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其爬上平臺并停留20s。上述訓(xùn)練的目的是使大鼠基本掌握水迷宮訓(xùn)練模式及搜索平臺的技巧。水迷宮訓(xùn)練結(jié)束24h后應(yīng)激組大鼠開始接受各種應(yīng)激刺激，第1、2、3、4周最后1天刺激結(jié)束后24h重復(fù)進(jìn)行8次定向航行實(shí)驗(yàn)。在此期間對照組大鼠不接受任何處理，與應(yīng)激組大鼠同步進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)。所有大鼠每次訓(xùn)練找到平臺的潛伏期由攝像裝置拍攝并傳輸?shù)接?jì)算機(jī)保存、分析。

1.4 激素水平檢測

分別于1、2、3、4 周應(yīng)激結(jié)束后，斷頭處死未進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練的應(yīng)激組和對照組大鼠各8只，取血，室溫下放置4h，3000r/min離心 15 min，取上清液(血清)，按照放射免疫分析試劑盒的說明書檢測皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)的水平。

1.5 免疫印跡法(Western blot)檢測ERK1/2的磷酸化水平

1.5.1 組織樣品處理 斷頭處死大鼠后，每組隨機(jī)選取3只取全腦，按照大鼠神經(jīng)解剖圖譜分離海馬、前額皮質(zhì)等腦區(qū)組織。分別稱取上述腦區(qū)組織各50mg于玻璃勻漿器中，加入500μl組織細(xì)胞裂解液(含50mmol/L Tris-HCl，pH 7.4;300mmol/L NaCl;10ml/L乙基苯基聚己二醇(Nonidet P-40);1 g/L SDS，1 mmol/L EDTA;1mmol/L Na3VO4，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF);蛋白酶抑制劑(cocktail))，勻漿，冰水浴約 20min，4℃、12000r/min離心 15 min，取少量上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法定量分析樣品中的總蛋白含量。其余上清液加入等量 2×SDS Sample Buffer，煮沸 5 min，保存于-80℃。

1.5.2 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western blot檢測ERK1/2的磷酸化水平 配制5%的積層膠和12%的分離膠;根據(jù)蛋白定量分析結(jié)果，調(diào)整各泳道樣品中蛋白總量一致。電泳80V/20min，120V/80min結(jié)束，250mA/90min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜;以封閉液(25mmol/L TBS溶液，50g/L脫脂奶粉，1 ml/L吐溫-20)室溫封閉 1 h。加一抗，于 4℃過夜;洗膜;加相應(yīng)二抗，37℃孵育 1.5 h;洗膜。滴加化學(xué)熒光試劑(美國Pierce公司)，在暗室中用X光膠片(Kodak)壓片成像。凝膠成像分析儀(美國SYNGENE公司)掃描各免疫印跡條帶灰度值并進(jìn)行分析。所使用抗體及稀釋濃度:p-ERK(鼠單抗，1:1000稀釋)，ERK1(兔多抗，1:3000稀釋)，二抗(羊抗鼠，1:2000稀釋;羊抗兔，1:6000稀釋);以上抗體均購于美國Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 慢性復(fù)合應(yīng)激對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

大鼠Morris水迷宮定位航行在接受慢性復(fù)合應(yīng)激以后第1周和第2周，找到隱藏平臺的潛伏期顯著延長(P＜0.05);第3周時(shí)雖然應(yīng)激組大鼠潛伏期絕對值略有延長，但兩者無顯著性差異(P＞0.05);而第4周時(shí)應(yīng)激組大鼠潛伏期比對照組顯著延長(P＜0.05，圖1)。上述結(jié)果提示慢性復(fù)合應(yīng)激損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，但是在第3周時(shí)有一短時(shí)間的恢復(fù)。

Fig.1 Effects of chronic stress on learning andmemory of rats in the Morris water maze test(，n=10)

2.2 慢性復(fù)合應(yīng)激對大鼠血清糖皮質(zhì)激素水平的影響

慢性應(yīng)激后，大鼠血清中CORT水平升高，1周和2周時(shí)均顯著高于對照組水平;3周時(shí)CORT水平有一定回落，與對照組水平無顯著性差異(P＞0.05);而4周時(shí)則再次升高，且顯著高于對照組水平(圖2)。

Fig.2 Effects of chronic stress on the serum CORT level of the rats(，n=8)

2.3 慢性復(fù)合應(yīng)激后不同腦區(qū)ERK1/2表達(dá)活化水平的改變

慢性復(fù)合應(yīng)激后，大鼠海馬P-ERK1/2水平在1周和2周時(shí)顯著降低(P＜0.05)，3周時(shí)水平有所恢復(fù)，與對照組水平無顯著性差異，而4周時(shí)P-ERK1/2水平又再次低于對照組水平。前額皮質(zhì)P-ERK1/2水平在慢性復(fù)合應(yīng)激后的變化與海馬基本一致，也呈降低-增高-降低的趨勢。而各時(shí)間點(diǎn)總ERK1/2水平無顯著變化(圖3)。

3 討論

應(yīng)激可以對學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生復(fù)雜的影響。近年來大量研究表明，應(yīng)激反應(yīng)可以對大腦功能(如學(xué)習(xí)記憶等)產(chǎn)生損害[2]，然而也有研究發(fā)現(xiàn)在某些情況下適度的應(yīng)激刺激可以有助于提高動物的學(xué)習(xí)記憶能力[3]。為了探討較長時(shí)間的應(yīng)激刺激對學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其機(jī)制，在本實(shí)驗(yàn)中我們通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察慢性復(fù)合性應(yīng)激后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變。結(jié)果顯示:慢性復(fù)合應(yīng)激后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降;而3周時(shí)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有所恢復(fù)。一般認(rèn)為:應(yīng)激反應(yīng)可以分為3期，即(1)警覺期，是機(jī)體對應(yīng)激的初步反應(yīng)，表現(xiàn)為心率加快、血壓升高、骨骼肌的血流量增加等，動用機(jī)體的防衛(wèi)機(jī)制以克服應(yīng)激。(2)抵抗期，此期是機(jī)體內(nèi)部防御力量處于高水平的狀態(tài)，機(jī)體與應(yīng)激原對峙的結(jié)果有兩種:一是機(jī)體戰(zhàn)勝了應(yīng)激原，內(nèi)環(huán)境重建穩(wěn)定;二是應(yīng)激原持續(xù)存在，機(jī)體受到損害而進(jìn)入衰竭期。(3)衰竭期，出現(xiàn)病理性應(yīng)激表現(xiàn)，內(nèi)環(huán)境紊亂和全身適應(yīng)綜合征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，慢性復(fù)合性應(yīng)激可以損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，3周時(shí)學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)可能是在較長時(shí)間的應(yīng)激反應(yīng)中，大鼠自身的防御力量逐漸與應(yīng)激刺激達(dá)到一種平衡關(guān)系;但是應(yīng)激時(shí)間達(dá)到4周時(shí)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力再次嚴(yán)重下降，這種現(xiàn)象可能是由于大鼠對應(yīng)激做出的自身調(diào)整在3周時(shí)達(dá)到了一種與應(yīng)激負(fù)荷之間的暫時(shí)性平衡，而應(yīng)激刺激繼續(xù)作用將可能打破這種平衡關(guān)系，從而損害大腦功能。

Fig.3 Effects of chronic stress on P-ERK levels in the hippocampus and prefrontal cortex of the rats(，n=4)

應(yīng)激的主要非特異性反應(yīng)之一是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPA)軸的激活，從而引起全身性代謝效應(yīng)、生理變化乃至行為改變和疾病發(fā)生。在應(yīng)激狀態(tài)下，CORT的濃度往往呈上升趨勢[4]，一方面可以幫助機(jī)體緩沖和適應(yīng)應(yīng)激刺激，但另一方面也是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生應(yīng)激疾病的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性應(yīng)激后，大鼠血清中CORT水平顯著增高，但在3周時(shí)出現(xiàn)恢復(fù)，與對照組水平無顯著差異。上述結(jié)果提示，慢性應(yīng)激可以顯著影響機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，長時(shí)間高水平激素的作用可能與應(yīng)激誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷密切相關(guān);3周時(shí)CORT水平的短時(shí)間下降可能與機(jī)體對應(yīng)激刺激的適應(yīng)性有關(guān)，而隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，機(jī)體則可能不再繼續(xù)適應(yīng)而造成損傷。

海馬、前額皮質(zhì)是與大腦學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)[5，6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號分子在上述腦區(qū)表達(dá)豐富，并對神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的介導(dǎo)作用，從而調(diào)控大腦功能。其中研究最多的是ERK1/2(分別為p44和p42 MAPK)，其主要功能與細(xì)胞的增殖與分化相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ERK是記憶形成的相關(guān)分子，海馬ERK1/2的磷酸化對于學(xué)習(xí)記憶過程是必不可少的[7]，使用 ERK通路阻斷劑PD98059能夠抑制海馬長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)的誘導(dǎo)[8]。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，慢性復(fù)合應(yīng)激可以引起大鼠大腦海馬、前額皮質(zhì)P-ERK水平的下降，3周時(shí)P-ERK水平有所回升，可能與機(jī)體的適應(yīng)有關(guān)，但4周時(shí)上述腦區(qū)P-ERK的水平再次下降。上述結(jié)果表明，慢性復(fù)合性應(yīng)激對大腦海馬、前額皮質(zhì)ERK信號分子磷酸化的作用主要是下調(diào)，而在3周時(shí)的短暫回升可能是由于機(jī)體對應(yīng)激刺激的適應(yīng)性變化引起的，而當(dāng)應(yīng)激刺激持續(xù)作用，機(jī)體不能繼續(xù)適應(yīng)時(shí)，P-ERK水平再次下降。Meller等[9]發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可以引起大鼠大腦ERK1/2磷酸化水平的降低，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，但該實(shí)驗(yàn)并未檢測慢性應(yīng)激影響MAPKs信號分子表達(dá)活化的時(shí)間效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)激后大鼠ERK1/2磷酸化水平具有與學(xué)習(xí)記憶能力相似的變化趨勢，提示慢性復(fù)合應(yīng)激可能通過降低海馬、前額皮質(zhì)ERK1/2的磷酸化水平而介導(dǎo)了大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

[1]Sandi C，Woodson J C，Haynes V F，et al.Acute stress-in-duced impairment of spatial memory is associated with decreased expression of neural cell adhesion molecule in the hippocampus and prefrontal cortex[J].Biol Psychiatry，2005，57(8):856-864.

[2]Kleen J K，Sitomer M T，Killeen P R，et al.Chronic stress impairs spatial memory andmotivation for rewardwithout disrupting motor ability and motivation to explore[J].Behav Neurosci，2006，120(4):842-851.

[3]Zheng G，Zhang X，Chen Y，et al.Evidence for a role of GABAA receptor in the acute restraint stress-induced enhancement of spatial memory[J].Brain Res，2007，1181:61-73.

[4]Roman O，Seres J，Pometlova M，et al.Neuroendocrine or behavioral effects of acute or chronic emotional stress in Wistar Kyoto(WKY)and spontaneously hypertensive(SHR)rats[J].EndocrRegul，2004，38(4):151-155.

[5]Morris R G，GarrudP，Rawlins J N.et al.Place navigation impaired in ratswith hippocampal lesions[J].Nature，1982，297(5868):681-683.

[6]Bussey T J，Wise S P，Murray E A.Interaction of ventral and orbital prefrontal cortex with inferotemporal cortex in conditional visuomotor learning[J].Behav Neurosci，2002，116(4):703-715.

[7]Selcher J C，Weeber E J，Varga A W，et al.Proteinkinase signal transduction cascades in mammalian associative conditioning[J].Neuroscientist，2002，8(2):122-131.

[8]English J D，Sweatt J D.A requirement for the mitogen-activated protein kinase cascade in hippocampal long term potentiation[J]，J Biol Chem，1997，272(31):19103-19106.

[9]Meller E，Shen C，Nikolao T A，et al.Region-specific effects of acute and repeated restraint stresson the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases[J].Brain Res，2003，979(1-2):57-64.