陸樹文，劉紅菊，趙 偉，李 莉，頓桓桓，梁 超△

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075;2.中國航天員科研訓練中心，北京 100094)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性非特異性胃腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)與克羅恩病(crohn's disease，CD)，是胃腸道中除惡性病變最嚴重的疾病之一。這種疾病通常反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，可有腹痛、腹瀉、體重減輕、粘液血便等表現(xiàn)。IBD西醫(yī)的傳統(tǒng)治療著眼于控制活動性炎癥和調(diào)節(jié)免疫紊亂，但長期藥物維持使用，其價格昂貴，一般人難以承受。本病屬中醫(yī)“痢疾”、“腸癖”、“腸風”、“泄瀉”、“臟毒”等范疇，中醫(yī)使用白頭翁湯治療具有臨床療效好、復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)小的優(yōu)點。目前對于其發(fā)病機制研究也取得了初步進展，實驗性 IBD小鼠模型中證實，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)在炎癥性腸病中的表達增加[1]，但由于過度表達的Smad7阻滯了TGF-β1信號途徑后促進IBD中致炎因子的持續(xù)升高，從而抑制了TGF-β1的抗炎能力。本實驗旨在通過觀察白頭翁湯對造模大鼠的TGF-β1及下游信號轉(zhuǎn)導因子Smads的表達變化的影響，探討白頭翁湯治療炎癥性腸病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

Wistar雄性大鼠40只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，普通級，體重(140±10)g，隨機分為5組(n=8):正常對照組、模型組、模型+陽性對照組、模型+中藥中劑量組、模型+中藥高劑量組。

1.2 實驗藥物及制備

白頭翁湯由白頭翁10g，黃連15 g，黃柏15 g，秦皮15 g(北京同仁堂提供)，藥物制備:A、中劑量組中藥制備:上述藥物置于搪瓷藥罐中，加適量蒸餾水浸泡2 h，加熱煮沸30min，濾出頭煎，藥渣加蒸餾水適量，再煮沸 30min，濾出二煎，合并2次濾液，加熱濃縮至濃度為396 g/L[2](生藥)，原液裝瓶，高壓消毒后密封保存。B、高劑量組中藥制備:將A組中藥繼續(xù)加熱濃縮至濃度為792 g/L[2](生藥)，原液裝瓶，高壓消毒后密封保存。C、陽性對照藥美沙拉嗪腸溶片(安徽東盛制藥有限公司)，美沙拉嗪腸溶片碾磨成粉，配成濃度為 30g/L[2]的混懸液。D、2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS，Sigma公司)制備:將濃度為5%(即 50g/L)的TNBS，使用前配制成3.0%TNBS-乙醇溶液(即5%TNBS 6 ml+無水乙醇4 ml)。

1.3 主要試劑

Smad7(Santa Cruz)，p-Smad3(Santa Cruz)，GAPDH(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(北京中山生物公司)，F(xiàn)ITC-標記羊抗兔IgG二抗(北京中山生物公司)，封閉用正常羊血清(北京中山生物公司)。

1.4 動物造模及取材

制備大鼠炎癥性腸病模型[3]:禁食不禁水24h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉，將直徑2 mm的乳膠管經(jīng)肛門輕輕插入大鼠體內(nèi)大約8 cm處的腸腔內(nèi)，給予2.5%的TNBS-乙醇溶液按75 mg/kg灌腸，然后注入約0.3 ml空氣，以排空管中的藥液，捏緊肛門，提起大鼠尾部，保持倒立30s，造模后大鼠平躺，自然清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。正常對照組給予同體積的生理鹽水灌腸，常規(guī)飼養(yǎng)。造模成功3天后，中藥治療組中、高劑量組每日分別給予相應(yīng)濃度的白頭翁湯2 ml灌胃治療，陽性對照組每日分別給予美沙拉嗪腸溶片混懸液2 ml灌胃治療，每日1次，共14天。正常對照組和模型組給予同等體積生理鹽水灌胃。第18天處死各組大鼠，剖腹，摘取肛門以上7 cm～8 cm結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剪開，取病變最明顯處液氮凍存，用于后續(xù)蛋白提取，部分組織置于4%多聚甲醛固定、冰凍包埋、切片。

1.5 免疫組化

(1)組織固定，常規(guī)脫水，冰凍切片，丙酮固定;(2)將切片放置在PBST中，洗3次每次5 min;(3)0.3%Triton X-100室溫作用30min，5%的羊血清室溫封閉1 h;(4)加入兔抗Smad7或p-Smad3一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜;(5)PBST洗 3次，每次10min，加入FITC-標記羊抗兔IgG二抗(1∶200稀釋)，室溫30min;(6)PBST 洗 3 次，每次 10min，DAPI封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析。

1.6 Western blot

(1)取50～100mg組織加入到1 ml組織裂解液中(已加入蛋白酶抑制劑)，用勻漿器在冰上充分勻漿，冰上裂解30min;(2)4℃，12000×g離心20min，取上清，將0.2 mg/ml的BSA稀釋成一系列標準溶液(0、25、50、100、200μg/ml)，取標準溶液和適當稀釋的待測樣品各20μl，加入5倍稀釋的蛋白濃度分析試劑中，振蕩混勻后，595 nm波長下測光密度值。以標準蛋白濃度的光密度值作標準曲線，計算待測樣品蛋白濃度;(3)分別配制12%的分離膠和5%的積層膠，灌制分離膠和積層膠，在樣品加入凝膠加樣緩沖液，沸水變性3～ 5 min 后 80μg/well上樣;(4)電泳:恒壓電泳，電泳至凝膠底部;取下凝膠，放入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10min;(5)NC膜在預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10min，在濕轉(zhuǎn)式電轉(zhuǎn)儀上以恒流進行電轉(zhuǎn);(6)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于TBS中漂洗3次，每次10min。封閉，室溫輕搖2 h。按照0.1 ml/cm2的比例加入用封閉液稀釋的抗Smad7或p-Smad3一抗，4℃輕搖過夜;(7)TBS-T洗3次，每次10min。按照0.1 ml/cm2的比例加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，在室溫振蕩2 h。(8)TBS-T洗3次，每次10min，ECL顯色。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測Smad7和p-Smad3在大鼠結(jié)腸組織中的表達

免疫熒光的結(jié)果顯示，同對照組相比，模型組Smad7表達顯著增加(P＜0.01)，而p-Smad3表達顯著降低(P＜0.01);應(yīng)用陽性藥物美沙拉嗪和白頭翁湯治療后，同模型組相比，均能明顯降低Smad7而增加p-Smad3的表達(P＜0.01)，尤其是高劑量白頭翁湯對Smad7和p-Smad3的表達調(diào)控作用同美沙拉嗪相當(圖1，圖2見下頁)。

2.2 Western blot檢測Smad7和p-Smad3在大鼠結(jié)腸組織中的表達

Western blot的結(jié)果顯示，同對照組相比，模型組Smad7表達顯著增加(P＜0.01)，而p-Smad3表達顯著降低(P＜0.01);同模型組相比，陽性藥物美沙拉嗪和高劑量白頭翁湯治療均能明顯降低Smad7而增加p-Smad3的表達(P＜0.01，圖3)，同免疫熒光結(jié)果一致。

Fig.1 Expression of Smad7 in colons from different groups by immunofluorescent(，n=3，Scale bars=50μm)

Fig.2 Expression of p-Smad3 in colons from different groups by immunofluorescent(，n=3，Scale bars=50μm)

Fig.3 Relative expression of Smad7 and p-Smad3 in colons from different groups by Western blot(，n=3)

3 討論

到目前為止炎癥性腸病的病因和確切的發(fā)病機理仍不清楚。但已有證據(jù)顯示免疫異常，特別是腸粘膜局部的免疫紊亂在IBD的發(fā)病中占有十分重要的地位，致炎因子/抗炎因子的失衡可能是疾病發(fā)生的原因之一。促炎癥細胞因子 (IL-1，IL-6，IL-8，TNF-α和IFN-γ)增多，抗炎細胞因子(IL-1受體拮抗劑，IL-10和TGF-β)減少，是引起腸粘膜免疫反應(yīng)異常和慢性炎癥的主要原因。TGF-β1在傷口愈合和組織修復(fù)中具有重要作用，是炎癥性腸病中控制膠原合成和介導腸纖維化的復(fù)雜調(diào)節(jié)機制中的重要生長因子[4，5]。TGF-β1可激活下游的Smad3，使其磷酸化后入核，調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其生物學效應(yīng);而Smad7則起到抑制TGF-β1/Smad3信號通路的作用。在實驗性IBD小鼠模型中已證實，TGF-β1的表達增加[1，6]，但 Smad7的過度表達阻滯了TGF-β1信號途徑，促進了IBD中致炎因子的持續(xù)升高，而抑制 Smad7的表達則可恢復(fù)TGF-β1的抗炎能力[7]。

同IBD小鼠模型相同，本實驗應(yīng)用TNBS造模大鼠后發(fā)現(xiàn)，Smad7蛋白水平在IBD發(fā)生時的高表達，而磷酸化的Smad3表達水平則受到抑制，一定程度阻斷了TGF-β1的作用，這與先前文章報道相一致[8]。另有文章也表明，Smad3靶向敲除的小鼠會發(fā)生劇烈的炎性反應(yīng)，這進一步證實了TGF-β1/Smad3信號通路在對抗粘膜炎性反應(yīng)中的重要作用[8，9]。在本研究中，我們應(yīng)用陽性藥物及高劑量白頭翁湯后均可有效對抗TGF-β1/Smad3信號通路中的抑制因子Smad7的高表達，而增加了活性因子Smad3磷酸化水平的表達，所以 TGF-β1/Smad3信號通路的激活使得TGF-β1能夠有效的發(fā)揮抗炎及修復(fù)損傷的能力。

綜上所述，本實驗表明，白頭翁湯可通過抑制Smad7、促進磷酸化Smad3表達水平，從而激活TGF-β1/Smad3信號通路，對IBD急性期大鼠發(fā)揮了顯著的抗炎作用及修復(fù)炎癥損傷的作用。

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