何承輝， 邢建國(guó)， 王新春， 于 寧， 王云飛

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院，新疆 石河子 832008;3.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832002)

香青蘭［1］滴丸是由香青蘭單味藥材制成的中藥新制劑，具有補(bǔ)益心腦，活血化淤，通絡(luò)開竅等功能，是治療冠心病、心絞痛、心肌缺血等疾病的有效藥物［2］。處方被收載于維吾爾古典醫(yī)籍《阿里卡農(nóng)》中，至今已有800多年的歷史［1］。田薊苷為香青蘭中含量較高的主要藥效成分之一［3－6］。為了有效控制制劑質(zhì)量，本試驗(yàn)建立了定量測(cè)定有效成分田薊苷及木犀草素的高效液相色譜法和定性鑒別田薊苷的薄層色譜法，結(jié)果所建立的方法準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)，可有效控制香青蘭滴丸的質(zhì)量，為香青蘭滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

SPD－10AVP型高效液相色譜儀(日本島津);BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平(sartorius);Millipore simplicity－185超純水器(美國(guó)密理博公司);KQ－100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);紫外分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司)。田薊苷對(duì)照品(批號(hào):20070408，新疆藥物研究所制備，純度＞98%)，木犀草素對(duì)照品(批號(hào)111520－200504)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。香青蘭滴丸新疆藥物研究所制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 香青蘭定性鑒別 取本品0.5 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，離心，取上清液作為供試品溶液。另取缺香青蘭陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。另取香青蘭藥材5 g，加入40%乙醇100 mL，回流提取3 h，離心，取上清液作為藥材溶液。另取田薊苷對(duì)照品適量，加入甲醇制成每1 mL含0.3 mg的田薊苷溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)［7］，分別吸取上述3種溶液各3μL，點(diǎn)于同一硅膠HF254薄層板上，分別以三氯甲烷－甲醇(8.5∶1.5)和甲苯－甲酸甲酯－甲酸(5∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果，供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn);陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖1和圖2。

圖1 香青蘭TLC鑒別(三 氯 甲 烷-甲 醇(8.5∶1.5)為展開劑)

1.田薊苷對(duì)照品 2.香青蘭藥材 3－5.3批樣品 6.陰性對(duì)照

2.2 田薊苷的含量測(cè)定［8－9］

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Shim－pack VP－ODS(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0.5% 甲酸(20∶80);檢測(cè)波長(zhǎng):324 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫為35℃，進(jìn)樣量:10 μL。理論塔板數(shù)按田薊苷計(jì)不應(yīng)低于3 000。色譜圖見圖3。

圖3 田薊苷HPLC圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取田薊苷對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得202 μg/mL的田薊苷對(duì)照品貯備液。精密吸取對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0及5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得田薊苷線性方程:A=509 212C(r=0.999 8)，田薊苷在10.1～101.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇約25 mL，超聲提取30 min，冷卻后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品 取按處方比例及制法制備的不含香青蘭藥材的滴丸約0.1 g，按2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液，依法測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2.5 精密度考察 精密吸取同一份田薊苷對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，計(jì)算田薊苷峰面積值的RSD為0.65%，標(biāo)明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，每隔2 h按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，共測(cè)定6次，計(jì)算供試品溶液中田薊苷峰面積值的RSD為1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)的香青蘭滴丸的細(xì)粉5份，各約0.1 g，按供試品溶液的制備項(xiàng)下處理，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算供試品溶液中田薊苷峰面積值的RSD為0.65%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品細(xì)粉9份，每份約0.05 g(含田薊苷約1.4 mg)，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，分別精密加入田薊苷對(duì)照品溶液，照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，制備高、中、低3濃度的供試溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為98.95%，RSD為2.21%。

表1 田薊苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品含量測(cè)定 分別取3批香青蘭滴丸樣品，按供試品溶液制備方法處理，按上述色譜條件下測(cè)定，外標(biāo)法求得香青蘭滴丸樣品中田薊苷的含量。結(jié)果見表2。每丸含田薊苷的平均值為0.805 6 mg(n=9)。

表2 3批樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3 木犀草素的含量測(cè)定［10－11］

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Shim－pack VP－ODS(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－0.4% 磷酸(47:53);檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫為35℃，進(jìn)樣量:10 μL。理論塔板數(shù)按木犀草素計(jì)不應(yīng)低于2 500。色譜圖見圖4。

圖4 木犀草素HPLC圖

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取木犀草素對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成988 μg/mL的木犀草素對(duì)照品貯備液。分別精密木犀草素對(duì)照品貯備液0.1、0.3、0.5、0.7及1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木犀草素線性方程為:A=40 215C(r=0.999 8)，木犀草素在9.88～98.8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 供試品溶液的制備 取香青蘭滴丸適量，研細(xì)，取細(xì)粉約0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇約15 mL，超聲提取20 min，冷卻后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性樣品 取不含香青蘭藥材制備的滴丸約0.1 g，按2.3.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備香青蘭陰性對(duì)照溶液，依法測(cè)定，結(jié)果陰性樣品無(wú)干擾。

2.3.5 精密度考察 精密吸取同一份木犀草素對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算木犀草素峰面積值的 RSD為0.48%，表明方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取供試品溶液10 μL，每隔2 h按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，共測(cè)定6次，結(jié)果供試品中木犀草素峰面積值RSD為1.21%，表明供試液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性考察 取供試品細(xì)粉5份，各約0.1 g，照2.3.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品木犀草素峰面積值RSD為0.75%。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品細(xì)粉9份，每份約0.03 g(含木犀草素約0.2 mg)，各精密稱定，分別置25 mL量瓶中，各精密加入木犀草素對(duì)照品溶液，照2.3.3項(xiàng)下供試品溶液的制備項(xiàng)下處理，使成高、中、低3濃度供試液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。平均回收率為99.10%，RSD為0.56%。

表3 木犀草素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取3批香青蘭滴丸樣品，按2.3.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，在2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算每批樣品中木犀草素的含量及RSD。結(jié)果見表4。每丸含木犀草素的平均值為0.24 mg(n=9)。

表4 3批樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 展開劑的選擇 在香青蘭的TLC鑒別研究過(guò)程中，分別考察了甲苯－乙酸乙酯－甲酸(4∶2∶0.1)、甲苯－乙酸乙酯－甲酸(5 ∶4 ∶2)、氯仿－甲醇(9∶1)、氯仿－甲醇(8.5∶1.5)等展開系統(tǒng)，結(jié)果表明，氯仿－甲醇(8.5∶1.5)的Rf值較合適，效果較好。

4.2 流動(dòng)相的選擇 有關(guān)HPLC測(cè)定田薊苷含量的文獻(xiàn)尚未見報(bào)道，在流動(dòng)相考察過(guò)程中，先后比較了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸、乙腈－磷酸等多種流動(dòng)相，結(jié)果，以乙腈－0.5%甲酸(20∶80)為流動(dòng)相，田薊苷的分離效果和峰形均為最佳，由此確定了本研究含量測(cè)定的流動(dòng)相。

4.3 樣品處理方法的選擇 在樣品處理方法的研究中，主要比較了超聲、回流兩種提取方法對(duì)田薊苷和木犀草素提取率的影響，結(jié)果兩種提取方法對(duì)田薊苷和木犀草素的提取率相當(dāng)，考慮超聲提取方法方便簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，最終樣品處理方法選擇為超聲提取法，超聲提取時(shí)間考察結(jié)果表明田薊苷提取0.5 h，木犀草素提取20 min為宜。

［1］劉勇民，沙吾提－伊克木.維吾爾藥志［M］.上冊(cè)，烏魯術(shù)齊:新疆人民出版社，1985:329.

［2］洪秀芳，魏 妤，王曉雯，等.香青蘭沖劑治療冠心病心絞痛療效分析［J］.新疆中醫(yī)藥，1999，17(2):38.

［3］Nam Ki－Hoan，Choi Jae－Hoon，SEO Yun－Jeong，et al.Inhibitory effects of tilianin on the expression of inducible nitric oxide synthase in low density lipoprotein receptor deficiency mice［J］.Exp Mol Med，2006，38(4):445－452.

［4］馮長(zhǎng)根，李 瓊.香青蘭化學(xué)成分與藥理活性研究綜述［J］.中成藥，2003，25(2):154.

［5］王建芬，徐 宇，李 芳，等.HPLC測(cè)定香青蘭藥材中的黃酮類成分［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22(3):348.

［6］吳壽金，趙 泰.現(xiàn)代中藥化學(xué)成分［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002:238.

［7］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:附錄31.

［8］麥路德木.麥麥吐遜，李 敏，胡君萍，等.益心巴迪然吉布亞(香青蘭)顆粒中總黃酮含量測(cè)定［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(5):568－569.

［9］宋 睿，金傳山，周亞偉.香青蘭中總黃酮和單體的含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(12):71.

［10］邢建國(guó)，魏改芹，何承輝.香青蘭滴丸制備工藝研究［J］.中草藥，2008，39(17):1173－1176.

［11］魏改芹，邢建國(guó)，何承輝.HPD100大孔吸附樹脂分離純化香青蘭中木犀草素的研究［J］.中成藥，2008，30(11):1608－1611.