李啟艷, 朱日然, 徐麗華
(1.山東省藥品檢驗所,山東 濟南 250010;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東濟南 250012)
銀屑顆粒由土茯苓、菝葜兩味藥組成,具有祛風(fēng)解毒的功效,臨床用于治療銀屑病。研究表明,土茯苓和菝葜均含有落新婦苷,為了確保藥品的安全有效,我們采用高效液相色譜法對落新婦苷進行定量測定[1-4]。
島津UV-2550紫外分光光度計,Mettler AE240電子天平,Agilent1200高效液相色譜儀。落新婦苷對照品,煙臺大學(xué)提供,供定量測定用。銀屑顆粒,山東魯泰環(huán)中制藥有限公司生產(chǎn)(批號:100401、100402、100403);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。
2.1 色譜條件[5-6]色譜柱 Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相 甲醇-0.1%磷酸(25 ∶75),體積流量1 mL/min;柱溫35℃;檢測波長291 nm。理論板數(shù)按落新婦苷峰計算應(yīng)不低于3 000。采用此色譜條件,供試品及對照品色譜分離度良好,見圖1、2。
圖1 落新婦苷對照品HPLC色譜圖
2.2 方法與結(jié)果
2.2.1 線性關(guān)系的考察 精密稱取落新婦苷對照品9.47 mg,加60%甲醇溶解并稀釋至100 mL,搖勻,作為對照品溶液(落新婦苷質(zhì)量濃度為0.094 7 mg/mL)。
圖2 供試品HPLC色譜圖
分別精密吸取上述對照品溶液各 2、4、8、12、16、20 μL,注入液相色譜儀,分別測定峰面積積分值。以落新婦苷對照品的進樣量為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),進行線性回歸,得回歸方程Y=2 276.444 0X+21.119 5,相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。表明落新婦苷進樣量在 0.189 4 ~1.894 0 μg之間與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。
2.2.2 精密度實驗 精密吸取上述對照液10 μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,按上述測定方法進行測定,結(jié)果落新婦苷峰面積積分值的RSD為0.43%,表明儀器精密度良好。
2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物(山東魯泰環(huán)中制藥有限公司生產(chǎn),批號:100401),研細(xì),取約1.0 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入60%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用60%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
精密吸取上述供試品溶液10 μL,每隔2 h進樣一次,測定落新婦苷的峰面積積分值,共考察8 h,以觀察樣品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性,結(jié)果RSD為0.08%,表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,能夠滿足測定需要。
2.2.4 重復(fù)性試驗 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物(山東魯泰環(huán)中制藥有限公司生產(chǎn),批號:100401),研細(xì),取約1.0 g,共取5份,按樣品測定項下的供試品溶液的制備方法,分別制得供試品溶液。按上述測定方法進行測定,計算落新婦苷的量,結(jié)果平均含落新婦苷為14.2 mg/袋,RSD為1.11%,表明本品測定方法的重復(fù)性良好。
2.2.5 回收率試驗 對照品貯備液的制備 精密稱取落新婦苷對照品13.45 mg,置100 mL量瓶中,加60%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(落新婦苷質(zhì)量濃度為0.134 5 mg/mL)。
取已測定的裝量差異項下本品內(nèi)容物(山東魯泰環(huán)中制藥有限公司生產(chǎn),批號:100401,平均裝量:5.958 6 g,含落新婦苷為14.2 mg/袋),研細(xì),取約 0.5 g,精密稱定,共取 5份,置圓底燒瓶中,精密加入落新婦苷對照品貯備液(落新婦苷對照品質(zhì)量濃度為0.134 5 mg/mL)10 mL,再精密加入60%甲醇15 mL,按樣品測定項下的供試品溶液的制備方法,制得供試品溶液。照上述測定方法進行測定,計算回收率,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,本方法的回收率良好。
取裝量差異項下的本品內(nèi)容物,研細(xì),取約1.0 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入60%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用60%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。進樣10 μL。3批樣品測定結(jié)果見表2。
表1 落新婦苷加樣回收率試驗結(jié)果
表2 樣品測定結(jié)果
根據(jù)上述測定結(jié)果,暫定本品每袋含土茯苓、菝葜以落新婦苷(C21H22O11)計,不得少于11.4 mg。
4.1 取落新婦苷對照品溶液,在200~400 nm之間進行掃描,結(jié)果落新婦苷在201 nm、291 nm處有吸收峰,其中291 nm處吸收最大,故選用291 nm作為檢測波長。
4.2 考察了超聲提取和回流提取兩種方法,并考查了提取時間對含量的影響,結(jié)果加熱回流提取效果優(yōu)于超聲提取。且回流提取1 h和1.5 h含量結(jié)果一致,表明回流提取1 h落新婦苷已基本提取完全,因此確定提取方法為:樣品加熱回流提取1 h。
4.3 考察了60%甲醇、50%乙醇、甲醇3種溶劑,結(jié)果甲醇回流提取量最低,為7.2 mg/袋;60%甲醇與50%乙醇提取量接近,分別為14.1 mg/袋和13.8 mg/袋。但50%乙醇與流動相組成相差較大,色譜峰峰形較差,故確定60%甲醇為提取溶劑。
4.4 原計劃對樣品中薯蕷皂苷元進行定量測定,但是通過試驗和查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn),根據(jù)2005年版《中國藥典》收載的方法對菝葜藥材中薯蕷皂苷元進行定量測定,很難檢出薯蕷皂苷元,即使檢出也很難達(dá)到現(xiàn)行《中國藥典》規(guī)定的要求(不低于0.04%),而所檢藥材均為正品。因此未建立薯蕷皂苷元的定量測定方法。
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