李仲昆， 尹為民， 王崇靜， 王 珩， 任曉明， 李 靜， 蔣立虹*

(1.昆明市延安醫(yī)院，云南昆明 650051;2.云南省第一人民醫(yī)院 云南昆明 650032)

蕁麻屬植物在我國已有近千年的藥用歷史，國外從古羅馬時期就開始藥用，德國已經(jīng)開發(fā)出治療風(fēng)濕、前列腺炎的產(chǎn)品，國外對大蕁麻和異株蕁麻進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)其可以用來治療前列腺增生、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性鼻炎、高血壓、心臟病、糖尿病，此外還具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)活性［1-3］。而我國目前尚無產(chǎn)品。研究論文都停留在抗炎方面，而對免疫調(diào)節(jié)方面的研究報道很少。本試驗(yàn)用環(huán)磷酰胺制備小鼠免疫功能低下的模型，然后給與口服粗根蕁麻提取物，通過測定小鼠血清溶血素、白細(xì)胞介素2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)、T 淋巴亞群 CD3、CD4、CD8 的量，觀察粗根蕁麻的免疫調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 動物

ICR雄性小鼠120只，購自昆明醫(yī)學(xué)院動物科，合格證號 SCXK(滇)2010-0008，體質(zhì)量(20 ±2)g。

1.2 藥物及主要試劑

1.2.1 受試物 粗根蕁麻Urtica MacrorrhizaHand-Mazz:采自云南賓川雞足山，由昆明植物所李錫文教授鑒定。

水提物的制備方法:將干燥后的粗根蕁麻粉碎后，經(jīng)過2次水提取，合并提取液，干燥后即得，一般可以得到10%的干燥品，即1 g相當(dāng)于10 g生藥。

粗多糖的制備方法:將干燥的水提物25 g，加水70 mL溶解，加95%乙醇350 mL，攪拌，傾去上層液體。沉淀加水50 mL溶解，加95%乙醇250 mL，攪拌，傾去上層液體，沉淀干燥后即得。可得9 g粗多糖，即1 g相當(dāng)于28 g生藥。

精制多糖的制備方法:將干燥的水提物25 g，加水70 mL溶解，加95%乙醇350 mL，攪拌，傾去上層液體。沉淀加水50 mL溶解，加95%乙醇250 mL，攪拌，傾去上層液體，此操作再重復(fù)2次，沉淀干燥后即得。可得6.5 g精制多糖，即1 g相當(dāng)于38 g生藥。

1.2.2 主要試劑 注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，09080521)。補(bǔ)體:抽取4只豚鼠心臟血，雌雄各半，分離新鮮血清，混合后備用，臨用時生理鹽水稀釋1∶10。雞紅細(xì)胞(5%CRBC)，取新鮮雞血，除去纖維蛋白，用生理鹽水制備為5%CRBC懸液備用。IL-2、IFN-γ試劑盒，購于昆明晶美公司。流式試劑 Mouse CD3E PE-CY5，mouse CD4 FITC，mouse CD8-PE，為BD公司試劑。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計(日本島津UV-2401-PC)。酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD680)。流式細(xì)胞儀(美國BD公司)

2 方法

2.1 粗根蕁麻對免疫低下小鼠血清溶血素的影響

2.1.1 模型制備［4］ICR雄性小鼠60只，隨機(jī)分為5組:對照組，模型組，粗根蕁麻A(水提物)、B(粗多糖)、C(精制多糖)組。實(shí)驗(yàn)開始后，粗根蕁麻A、B、C組灌服藥物，共給藥7 d，給藥劑量為0.5 g/kg。對照組、模型組每天灌服水0.3mL。對照組、模型組、粗根蕁麻A、B、C組第1天腹腔注射5%CRBC懸液0.4mL，模型組、粗根蕁麻A、B、C組在第2天腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg。第8天按照2.1.2項(xiàng)下進(jìn)行測定。

2.1.2 溶血素測定 給藥后第8天摘取小鼠眼球取血，注入1.5 mL塑料離心管中，室溫放置1 h，離心分離血清，取血清，用生理鹽水稀釋200倍，取稀釋血清2.0 mL與5%雞紅細(xì)胞混懸液1.0 mL，10%補(bǔ)體血清1.0 mL混合，在37℃恒溫箱孵育30 min，0℃冰箱中放置30 min終止反應(yīng)，離心取上清液，在紫外分光光度計540 nm處，測吸光度OD值。以不加血清的空白對照管上清液作對照比色。

2.2 粗根蕁麻對免疫低下小鼠 IL-2、IFN-γ、CD3、CD4、CD8的影響

2.2.1 模型制備［5-6］ICR 雄性小鼠60只，隨機(jī)分為 5組:空白對照組(Control)、模型組(Model)，粗根蕁麻A(水提物)、B(粗多糖)、C(精制多糖)組。實(shí)驗(yàn)開始后，粗根蕁麻A、B、C組灌服藥物，共給藥7 d，給藥劑量為0.5 g/kg?？瞻讓φ战M、模型組每天灌服水0.3 mL。除空白對照組，其余各組在第2天腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg。第8天取血。

2.2.2 測定:取血清按照小鼠酶聯(lián)免疫(ELISA)IL-2、IFN-γ試劑盒使用說明操作，測定小鼠血清中IL-2、IFN-γ的水平。肝素抗凝血當(dāng)天用流式法測定T細(xì)胞亞群。

3 結(jié)果

3.1 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

粗根蕁麻A、B、C均可對抗環(huán)磷酰胺所致小鼠血清溶血素水平的降低，與模型組比有顯著差異。結(jié)果見表1。

3.2 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ的影響

粗根蕁麻A、B、C可增加環(huán)磷酰胺小鼠血清IL-2、IFN-γ的水平。與模型組比較有顯著差異。結(jié)果見表2。

表1 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠血清溶血素試驗(yàn)結(jié)果

表2 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ的影響

3.3 粗根蕁麻提取物對免疫抑制小鼠T細(xì)胞亞群的影響

模型組的CD3、CD4百分比均明顯低于對照組(P＜0.05)，粗根蕁麻 A、B、C 組的 CD3、CD4百分比均明顯高于模型組(P＜0.05)。模型組與粗根蕁麻A、B、C組比較，CD4/CD8明顯偏低(P＜0.01)。見表3。

表3 粗根蕁麻提取物對小鼠T細(xì)胞亞群的影響

4 討論

體液免疫效應(yīng)是由B細(xì)胞通過對抗原的識別、活化、增殖，最后分化成漿細(xì)胞并分泌抗體來實(shí)現(xiàn)的。血清中溶血素水平的高低是衡量體液免疫的重要指標(biāo)。［7-9］

本試驗(yàn)結(jié)果表明灌服粗根蕁麻組光密度值與環(huán)磷酰胺組相比顯著提高，即血清溶血素水平升高，有顯著差異，從而證明粗根蕁麻對小鼠體液免疫功能具有顯著促進(jìn)作用。

本研究中，粗根蕁麻組小鼠的IL-2和INF-γ水平顯著高于模型組，說明粗根蕁麻能提高小鼠的免疫防御功能。IL-2可誘導(dǎo)部分B細(xì)胞分泌生長因子以及造血因子，還能激活巨噬細(xì)胞，最終使免疫效應(yīng)擴(kuò)大和增強(qiáng)。INF-γ具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，能增強(qiáng)細(xì)胞功能，加快免疫復(fù)合物清除和提高吞噬異物功能，對淋巴細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用。

本研究中，模型組的總T淋巴細(xì)胞(CD3)及CD4百分比均明顯低于對照組，說明環(huán)磷酰胺對小鼠細(xì)胞免疫功能有損傷。粗根蕁麻A、B、C組的總T淋巴細(xì)胞(CD3)及CD4百分比均明顯高于模型組，說明粗根蕁麻對受損的小鼠細(xì)胞免疫功能有恢復(fù)作用。從CD4/CD8分析，模型組與粗根蕁麻A、B、C組比較明顯偏低，提示粗根蕁麻可能通過提高CD4/CD8改善小鼠細(xì)胞免疫功能。

由此可見，粗根蕁麻可以用于輔助治療免疫功能低下導(dǎo)致的各種疾病，如過敏性疾病、腫瘤、糖尿病等。

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