北豆根中蝙蝠葛堿的穩(wěn)定性研究

劉全宇， 劉文義

(1.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所，黑龍江 哈爾濱 150069;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154000)

北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauriccmD的干燥根莖，始載于《中國(guó)藥植志》［1］，苦，寒，歸肺、胃、大腸經(jīng)。清熱解毒，祛風(fēng)止痛。主要成分為生物堿，約1%以上［2］。其總堿具有祛痰鎮(zhèn)咳作用［3］，制劑臨床上常用于治療咽喉炎。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其中的酚性總堿和蝙蝠葛堿(Dauricine)對(duì)腦梗塞和心肌缺血有良好的治療作用［4］，梁文杰等［5］證實(shí)北豆根的醇提物，主要成分為蝙蝠葛堿，對(duì)人紅白血病細(xì)胞株、人胃癌細(xì)胞株及TE13腫瘤細(xì)胞的增殖反應(yīng)均有明顯的抑制作用，且對(duì)腫瘤組織原代培養(yǎng)細(xì)胞增殖反應(yīng)具抑制作用。在開(kāi)發(fā)新藥研究上，有很好的利用價(jià)值。

蝙蝠葛堿為雙芐基異喹啉類結(jié)構(gòu)，白色粉末，研究中發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)成分穩(wěn)定性較差，光照或室溫長(zhǎng)時(shí)間放置后均變黃，受外界環(huán)境的物理和化學(xué)因素影響而發(fā)生含量下降成分降解的現(xiàn)象?？偵飰A中雙芐基異喹啉類生物堿量最高［6］，作為主要的活性成分，其穩(wěn)定性直接影響了制劑的性質(zhì)。王楠等［7］對(duì)北豆根酚性總堿粉針劑中蝙蝠葛堿量進(jìn)行了室溫下3個(gè)月的初步穩(wěn)定性考察。通過(guò)HPLC法測(cè)定，3個(gè)月內(nèi)總堿中蝙蝠葛堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在70%左右。在劇烈還原條件下，雙芐基異喹啉類生物堿雜環(huán)可發(fā)生裂環(huán)反應(yīng)生成季銨鹽［8］。陳勇等［9］在對(duì)北豆根生物堿的質(zhì)譜研究中，發(fā)現(xiàn)雙芐基異喹啉類生物堿亦可氧化開(kāi)環(huán)并失去N甲基而生成季銨鹽。在雙芐基異喹啉生物堿氧原子的研究中發(fā)現(xiàn)，某些生物堿中含有酚羥基，在酸堿條件下，如遇到酸酐、酰氯及羧酸等?；瘎┳饔?，可得O-?；铮?0］。

穩(wěn)定性研究目的是考察原料藥或制劑的性質(zhì)在溫度、濕度、光線等條件的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律，為藥品的生產(chǎn)、包裝、貯存、運(yùn)輸條件和有效期的確定提供科學(xué)依據(jù)，以保障臨床用藥安全有效［11］。本試驗(yàn)對(duì)蝙蝠葛堿單體的溫度，光照等因素進(jìn)行探討。

1 方法學(xué)考察

1.1 儀器、試劑和樣品

LC-2010型HPLC(日本島津);真空恒溫干燥箱;紫外燈;乙腈、甲醇為色譜純;三乙胺、磷酸為分析純;蝙蝠葛堿對(duì)照品(純度99.15%)，蝙蝠葛堿供試品均為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 色譜條件 色譜柱:ODS-C18柱(Hypersil ODS2，4.6 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相緩沖液(將 0.68 mL 磷酸和0.71 mL的三乙胺加純凈水至500 mL，過(guò)0.45 μm水系微孔濾膜)-乙腈(76∶24);檢測(cè)波長(zhǎng)281 nm;柱溫40℃;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL［4］。

1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蝙蝠葛堿對(duì)照品0.012 6 g置于50 mL量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm水系微孔濾膜，配成質(zhì)量濃度為0.252 0 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.4 線性關(guān)系 取對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(質(zhì)量)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=382 796X－21 727，r=0.999 9。表明蝙蝠葛堿在 0.504 0 ～2.520 0 mg質(zhì)量范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

1.5 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，其峰面積的積分值。RSD為0.18%，表明試驗(yàn)設(shè)備精密度良好。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品的5個(gè)試樣按1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行測(cè)定，記錄峰面積值，RSD為1.05%，表明樣品測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。

1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取同一供試品溶液，每隔2 h測(cè)定1次，測(cè)定5次。記錄其峰面積的積分值，RSD為0.36%，表明10 h內(nèi)該測(cè)定方法穩(wěn)定可靠。

1.8 回收率試驗(yàn) 取已知濃度的供試品溶液，精密稱定5份，分別加入蝙蝠葛堿對(duì)照品10 mL(相當(dāng)于2.520 0㎎)量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，按樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算回收率，5份樣品平均回收率為99.99%，RSD為0.37%(n=5)，回收率較高方法可靠。

2 溫度對(duì)蝙蝠葛堿的影響

采用經(jīng)典法(恒溫加速試驗(yàn)法)，將蝙蝠葛堿適量分別放置于40、60、80、100℃的恒溫箱中進(jìn)行加速試驗(yàn)，每隔5 d取樣進(jìn)行定量分析。稱取每批樣品約5 mg置于50 mL量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm水系微孔濾膜。使用1.2項(xiàng)下HPLC法測(cè)定。見(jiàn)表1～2。

表1 不同時(shí)間和不同溫度條件下蝙蝠葛堿的測(cè)定結(jié)果

將上述數(shù)據(jù)以lgC對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作回歸方程，符合方程:lgC=－K/2.303t+lgC0。可確定蝙蝠葛堿隨時(shí)間，溫度變化符合一級(jí)降解反應(yīng)。求得各溫度點(diǎn)的K值及l(fā)gK。

表2 不同溫度條件下蝙蝠葛堿穩(wěn)定性參數(shù)

蝙蝠葛堿的降解速率常數(shù)隨溫度增大而逐漸增大，根據(jù)Arrhenius公式:得 lgK= －2 622.6/T+4.973 1，r=0.957 5。外推得K25℃=1.502 6 × 10－4，K0.925℃=0.105 4/0.000 150 264≈701.4(d)=1.92(年)。表明在25℃室溫條件下蝙蝠葛堿下降1 0%需要大約1.92年。

3 光照對(duì)蝙蝠葛堿單體的影響

將蝙蝠葛堿適量分別放置于避光陰涼處、4 500lx光強(qiáng)度的日光燈光照箱及365 nm紫外燈照射下，每隔5 d取樣進(jìn)行定量分析。稱取每批樣品約5 mg置于50 mL量瓶中，加緩沖液超聲20 min溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm水系微孔濾膜。使用1.2項(xiàng)下HPLC法測(cè)定。見(jiàn)表3，圖1。

表3 光照因素下蝙蝠葛堿的測(cè)定結(jié)果

避光陰涼條件下:lgC= －6.397 5×10－5t+2，‘r=0.999 4，K=1.473 3 × 10－4，K0.9=715.4。日光光照箱下:lgC= －1.987 6 ×10－4t+2，r=0.995 6，K=4.577 4 × 10－4，K0.9=230.3。365 nm 紫外光條件下:lgC= －3.344 1 ×10－4t+2，r=0.999 1，K=7.701 5 ×10－4，K0.9=136.9。

蝙蝠葛堿變化速率K紫外光＞K日光＞K避光。光因素影響明顯。

圖1 蝙蝠葛堿穩(wěn)定性色譜圖

4 討論

藥物的穩(wěn)定性包括物理穩(wěn)定性、生物穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。蝙蝠葛堿由兩個(gè)芐基異喹啉類結(jié)構(gòu)通過(guò)醚鍵連接，含有酚羥基與N原子，為酚性生物堿。單體長(zhǎng)時(shí)間放置或經(jīng)歷高溫光照等因素后，顏色由白色轉(zhuǎn)向淡黃色，含量下降。對(duì)其化學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行探討，蝙蝠葛堿單體在室溫條件下t0.9大約1.92年，比較穩(wěn)定。隨著溫度增加，其變化速率加快，以lgC對(duì)t做圖，|r|均大于0.99，線性良好，表明蝙蝠葛堿降解規(guī)律均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。

由于吸收給定波長(zhǎng)的光子往往是分子中某個(gè)基團(tuán)的性質(zhì)，所以光化學(xué)提供了使分子中某特定位置發(fā)生反應(yīng)的最佳手段［12］。蝙蝠葛堿結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)的不飽和共軛體系與酚羥基，既有發(fā)色團(tuán)又有助色團(tuán)。本試驗(yàn)在HPLC上發(fā)現(xiàn)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，蝙蝠葛堿含量降低，兩側(cè)出現(xiàn)小的雜質(zhì)峰，推測(cè)其在光照條件下分解成其他成分。本試驗(yàn)以考察蝙蝠葛堿單體的含量變化出發(fā)，根據(jù)2010年《中國(guó)藥典》［13］規(guī)定，光強(qiáng)化試驗(yàn)應(yīng)以裝有日光燈的光照箱，光強(qiáng)度以4500lx±500lx的條件下第5、10天取樣檢測(cè)。本試驗(yàn)選擇避光、450 0lx日光光照箱及365 nm紫外燈條件對(duì)蝙蝠葛堿，每隔5 d取樣測(cè)定至30 d，結(jié)合試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出蝙蝠葛堿在避光、日光以及紫外燈情況下降解均符合合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。蝙蝠葛堿單體光因素下不穩(wěn)定，應(yīng)保存在避光陰涼處。

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