洪小鳳， 王 濤， 施貴榮， 王立云， 李 輝*

(1.云南省大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000;2.云南省大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000)

紫地榆Geranium strictipesKnuth，牻牛兒苗科老鸛草屬植物，藥用部位為根，民間稱隔山消。該藥在《大理中藥資源志》、《中藥大辭典》、《全國(guó)中草藥匯編》等書籍中均有收載。其在民間主要用于治療厭食、腸炎、紅白痢疾、消化不良等病癥［1］。已報(bào)道的化合物主要是鞣質(zhì)類和酚酸類［2］，而對(duì)該藥的有關(guān)藥理、毒理、臨床應(yīng)用、藥材標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報(bào)道都非常少。為了探討隔山消在民間治療腸炎、紅白痢疾的藥理作用基礎(chǔ)，本課題組前期對(duì)隔山消粗提取物的體內(nèi)外抗菌作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的廣譜抗菌作用［3］。為此，我們進(jìn)一步研究隔山消不同極性部位提取物對(duì)臨床分離的耐藥菌株和常見致病菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥材 隔山消，購(gòu)自大理集盛大藥房。經(jīng)鑒定為牻牛兒苗科植物紫地榆Geranium strictipesKnuth的干燥根。

1.2 供試菌株 金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，均由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室惠贈(zèng)。

所有31株臨床分離金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌來自大理州醫(yī)院住院病人和門診病人。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色特點(diǎn)和膠乳凝集試驗(yàn)，經(jīng)VITEK-32全自動(dòng)微生物分析儀GPI鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn))做菌株鑒定。共鑒定出MRSA13株、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌15株、銅綠假單胞菌1株。

1.3 培養(yǎng)基 MH瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào):090817);MH肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào):090526)。

1.4 儀器設(shè)備 AV-3070垂直型超凈工作臺(tái)(TELSTAR)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 耐藥菌株的篩選 采用液體稀釋法，參照NCCLS/CLIS2006 標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果［4］。

1.5.2 藥物的提取 取隔山消10.95 kg，粉碎后用85%乙醇回流提取3次。合并提取液減壓濃縮得乙醇浸膏3.58 kg。浸膏用甲醇溶解后，用80～100目硅膠拌樣，過硅膠柱層析，然后分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮洗脫，濃縮各組分得石油醚部分、三氯甲烷部分、乙酸乙酯部分、丙酮部分。因石油醚部分和三氯甲烷部分量太少，此次實(shí)驗(yàn)只做乙酸乙酯部分及丙酮部分。臨用前取乙酸乙酯和丙酮部分低溫冷凍干燥成粉末，再用適當(dāng)溶劑配制成所需濃度。

1.5.3 抑菌圈試驗(yàn)菌片的制備 將定性濾紙制成6 mm直徑的圓片，高壓蒸汽滅菌，干燥保存?zhèn)溆谩Ｈ√幚砗玫臑V紙片放入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每100片紙片滴加隔山消提取液100 μL，對(duì)照組滴加100 μL溶劑，每片含生藥量約為2.57 mg。1.5.4 細(xì)菌懸液的制備［5-6］將所有供試菌株分別接種于MH瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h活化，待用。挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度，使其相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用MH肉湯稀釋至含菌量約107CFU/mL。稀釋后的菌液在15 min內(nèi)接種。

1.5.5 MIC及MBC的測(cè)定［5-6］取滅菌小試管15支為一組。其中每組第13、14、15管分別標(biāo)上“肉湯對(duì)照”、“檢測(cè)菌對(duì)照”、“溶劑對(duì)照”。每支試管分別加入MH肉湯2 mL。配制隔山消乙酸乙酯提取物和丙酮提取物原液濃度為100 mg/mL。用吸管吸取藥液2 mL放入第1管內(nèi)，混勻后吸取2 mL放入第2管，同樣混勻后吸出2 mL放入第3管。依此法逐管進(jìn)行稀釋至第12管。各管藥物濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg/mL，除“肉湯對(duì)照”管外其余各管均加入菌液0.1 mL，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察生長(zhǎng)情況。在對(duì)照管符合要求的情況下，以肉眼未見生長(zhǎng)的最低藥物濃度為隔山消對(duì)細(xì)菌的MIC。再?gòu)奈匆娂?xì)菌生長(zhǎng)的試管中取0.02 mL于相應(yīng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。平皿上計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落的最低藥物濃度為隔山消對(duì)細(xì)菌的MBC。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.5.6 K-B實(shí)驗(yàn)法 用無菌棉簽蘸取0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后在瓊脂表面均勻涂布，然后將含藥紙片貼于瓊脂表面。置37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育18～20 h后觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑。各稀釋液的每項(xiàng)抑菌圈實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)6次。

結(jié)果判斷:抑菌圈直徑大于6 mm者為有抑菌作用，小于或等于6 mm者判為無抑菌作用。溶劑對(duì)照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無效。

2 結(jié)果

2.1 隔山消提取物對(duì)各供試菌株的MIC和MBC測(cè)定

隔山消乙酸乙酯提取物和丙酮提取物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 隔山消提取物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株的MIC及MBC結(jié)果

由表1結(jié)果顯示，隔山消提取物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株均有不同程度的抑制作用，對(duì)葡萄球菌、痢疾志賀菌的抑制作用最強(qiáng)，乙酸乙酯部分MIC值均為0.39 mg/mL，丙酮部分均為0.78 mg/mL。對(duì)枯草芽孢桿菌作用次之，乙酸乙酯部分MIC值為1.56 mg/mL，丙酮部分為 3.125 mg/mL。

2.2 隔山消提取物紙片擴(kuò)散法的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，100、50、25 mg/mL的乙酸乙酯和丙酮提取物對(duì)MRSA及標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯抑制作用，并且隨著濃度降低抑菌圈明顯縮小(與對(duì)照組比較，P﹤0.001)。乙酸乙酯提取物抑菌圈大于相應(yīng)濃度的丙酮提取物，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.001)。各相應(yīng)濃度抑菌圈直徑與ATCC25923比較沒有明顯差異。

表2 隔山消提取物對(duì)13株MRSA菌株的抑制作用

表3結(jié)果顯示，隔山消提取物50、25、12.5 mg/mL 3個(gè)濃度對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、痢疾志賀菌、枯草桿菌有不同程度的抑菌效果。

3 討論

目前，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的腸桿菌科細(xì)菌已成為一些大型綜合醫(yī)院最常見的醫(yī)院感染菌。同時(shí)又表現(xiàn)為多重耐藥性，給臨床治療帶來了極大的困難。

表3 隔山消提取物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隔山消總提取物具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，因此擬定對(duì)其抗菌活性部位進(jìn)行進(jìn)一步追蹤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隔山消總提取物經(jīng)硅膠柱層析得到的乙酸乙酯部分和丙酮部分對(duì)各菌株均顯示出不同程度的體外抗菌活性，尤其是對(duì)葡萄球菌科細(xì)菌及痢疾志賀菌的抑制作用最強(qiáng)。整體來講，乙酸乙酯提取物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用較丙酮提取物略強(qiáng)。同一種提取物對(duì)MRSA、產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的不同菌株表現(xiàn)出相近的抑菌活性。并且，隔山消提取物對(duì)臨床分離株和教學(xué)用的實(shí)驗(yàn)菌株也表現(xiàn)出相近的抑制作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隔山消兩種提取物對(duì)MRSA均有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其是乙酸乙酯部分。目前，本課題組正針對(duì)乙酸乙酯部分進(jìn)行進(jìn)一步的分離及活性追蹤，以期篩選出抗菌活性更強(qiáng)的天然抑菌劑。

［1］中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志［M］.第5卷，北京:科學(xué)出版社，1991:85.

［2］楊國(guó)紅，陳道峰.紫地榆的化學(xué)成分及其抗艾滋病病毒活性［J］.中草藥，2007，38(3):352-354.

［3］張嫻文，李鳳賢，王 晶.隔山消的抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中成藥，2009，31(6):127-129.

［4］NCCLS.Performance Standards for Antimicrocbial Susceptility Testing:Sixteenth Informational Supplement［S］.National Committee for Clinical Laboratory Standards，2006.

［5］陳 奇，卞如濂，陳 修.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:274-277.

［6］李志富，毛文奎，邵 偉，等.石榴皮乙醇提取物對(duì)臨床分離菌株的抗菌作用及毒性試驗(yàn)研究［J］.中國(guó)消毒學(xué)雜志，2009，26(2):162-164.