李玲，劉殿高，張譯文，趙春杰

(沈陽藥科大學藥學院，110016)

烏頭湯是東漢著名醫(yī)家張仲景創(chuàng)制的名方，該方由制黃芪、麻黃、芍藥、甘草(炙)、川烏組成，具有溫經散寒、祛濕鎮(zhèn)痛的功效，主治寒濕痹癥［1］。方中以川烏溫經祛濕、散寒鎮(zhèn)痛，芍藥緩急舒經鎮(zhèn)痛，以利筋骨屈伸［2］。制川烏與麻黃相配，祛痹鎮(zhèn)痛之力較著［3］。烏頭雖是有毒之品，在臨床上卻廣泛應用于風寒濕痹、關節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉鎮(zhèn)痛等［2］。烏頭中的有毒成分也是其有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，甘草、白芍等對烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿影響較大［4］。而藥物與劑量是影響方劑療效的兩大因素，藥物組成相同的方劑，在劑量或配比不同時療效迥異，日本學者渡邊熙說:“漢藥之秘，不可告人者，即在藥量［5］。”因此，筆者在本實驗中考察烏頭湯中制川烏與其余各味藥不同配比時對新烏頭堿和次烏頭堿含量的影響，以期調整和改善烏頭湯的組成配比，在其毒性不超限量的前提下，使新烏頭堿和次烏頭堿的含量達到較大值，以加強治療效果。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國 Agilent公司)，RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，BS110型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，TG332A型微量分析天平(上海分析天平廠)，AUTOSCIENCE AS3120超聲儀(功率 120 W，頻率40 kHz)。次烏頭堿、新烏頭堿標準品(均購于中國藥品生物制品檢定所，批號分別為0798-9403和0799-9403)。制川烏、麻黃、白芍、黃芪、炙甘草均購自沈陽四方藥大藥房，并經沈陽藥科大學中藥學院賈景明副教授鑒定，分別為Aconiti Radix Cocta，Ephedrae Herba，Paeoniae Radix Alba，Astragali Radix，Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praeparata Cum Melle。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫:30 ℃，流動相 A:乙腈-四氫呋喃(25∶15)，流動相 B:0.1 mol·L-1醋酸銨(每1 000 mL加冰醋酸 0.5 mL)，A-B(20∶80);流速:1.0 mL·min-1，檢測波長:235 nm。

2.2 供試品溶液的制備 烏頭湯中制川烏6 g為定值，其他各味藥材(麻黃、白芍、黃芪、甘草)按照表1安排正交實驗，采用L25(56)正交實驗表，以新烏頭堿和次烏頭堿的含量之和作為考察指標。取組方中各藥材，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液5 mL，精密加入乙酸乙酯-異丙醇(1∶1)溶液100 mL，稱定質量，超聲提取(功率120 W，頻率40 kHz，水溫＜25℃)30 min，放冷，再稱定質量，用上述溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑至干(＜40℃)，殘渣用異丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶解并定容至5 mL量瓶中，用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過，即得。

表1 正交實驗因素水平表Tab．1 The factors and levels g

2.3 對照品溶液的制備 取新烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，精密稱定，分別加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶解并制成0.396和0.974 mg·mL-1的對照品溶液。

2.4 色譜系統(tǒng)適用性實驗 取供試品溶液、對照品溶液，按“2.1”項色譜條件分別進樣5 μL分析，結果如圖1所示，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5。拖尾因子均在0.95～1.05之間。新烏頭堿、次烏頭堿的儀器精密度RSD分別為1.1%和1.9%。

2.5 標準曲線的繪制 分別精密量取新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液適量，置5 mL量瓶中，用異丙醇-三氯甲烷(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件下進樣5 μL，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果新烏頭堿、次烏頭堿回歸方程分別為Y=4.253X+30.98(r=0.999 4)，Y=3.713X+96.02(r=0.999 3)，線性范圍分別為4.95 ～79.20，12.18 ～194.80 μg·L-1。

2.6 烏頭湯中各組分對新烏頭堿和次烏頭堿的影響 按表2下的各組分正交實驗組方制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下進樣5 μL，將測得的新烏頭堿、次烏頭堿峰面積分別代入“2.5”項下標準曲線中，計算各配比組方中新烏頭堿、次烏頭堿的含量，結果見表2。

圖1 2種溶液的典型色譜圖A.樣品溶液;B.混合對照品溶液 (新烏頭堿396 μg·mL-1，次烏頭堿 974 μg·mL-1);1.新烏頭堿;2.次烏頭堿Fig．1 Representative chromatogram of the two kinds of solutionsA.sample;B.mixed reference substance(mesaconiatine 396 μg·mL-1，hypaconitine 974 μg· mL-1);1.mesaconiatine 2.hypaconitine

由表2可見，各因素對新烏頭堿和次烏頭堿含量之和的影響為D＞C＞A＞B，最佳水平組合為A5B1C2D5，即黃芪、炙甘草各13 g，麻黃5 g，白芍7 g。

綜合分析，烏頭湯中制川烏與其余各味藥的不同配比對新烏頭堿和次烏頭堿含量影響很大，其中炙甘草的量影響最大，白芍次之。當制川烏、麻黃、黃芪、白芍和炙甘草組方為 6，5，13，7，13 g時，新烏頭堿和次烏頭堿含量之和最大。

2.7 制川烏的雙酯型生物堿檢查 根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版的規(guī)定，制川烏含雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的總量計，不得超過0.040%。本實驗中因制川烏所含烏頭堿的量很少或幾乎沒有而未被檢測到，所以制川烏中雙酯型生物堿的量以新烏頭堿和次烏頭堿的總量計，其含量值最大為0.003 5%，遠小于規(guī)定值，因此符合規(guī)定。

3 討論

筆者在本實驗中以制川烏的量為定值，在原方的基礎上，設計烏頭湯中其余各味藥進行正交實驗得到不同的組成，與制川烏進行配比，考察各味藥的用量對制川烏中有效成分的影響，以期改善原方的用量配比，達到最佳的治療效果。本實驗以流動相A∶ 乙腈-四氫呋喃(25∶15)，流動相 B:0.1 mol·L-1醋酸銨(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動相，A-B(20∶80)梯度洗脫，比《中華人民共和國藥典》2010年版梯度洗脫的方法有所改進，能夠簡化實驗程序，且基線穩(wěn)定，漂移程度?。?］。

表2 新烏頭堿，次烏頭堿含量之和正交實驗結果Tab．2 The results of orthogonal test on the content sum of mesaconiatine and hypaconitine

本實驗旨在考察烏頭湯的組方配比對制川烏中雙酯型生物堿的影響，因此采用《中華人民共和國藥典》2010年版方法以乙酸乙酯-異丙醇(1∶1)溶液超聲提取，而不是采用傳統(tǒng)的水煎煮提取，目的是提高提取效率和新烏頭堿及次烏頭堿的含量，有利于測定。

本實驗僅從烏頭湯所含的新烏頭堿和次烏頭堿的量的總和在不超過限量的前提下達到較大值方面進行考察，下一步將會進行藥效實驗，將新組方與原方對比，考察新組方的實際療效。

［1］ 劉偉棟，施旭光，曠永強，等.烏頭湯對RA大鼠相關細胞因子影響的研究［J］.中藥材，2009，32(8):1267-1269.

［2］ 余成浩.烏頭類有毒中藥常用配伍藥對的物質基礎研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學，2006.

［3］ 劉娜，劉文.HPLC法測定烏頭湯水煎液中鹽酸麻黃堿的含量［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2008，20(7):33-35.

［4］ 劉忠英.中藥化學成分在炮制、配伍和提取過程中的化學變化及其轉運機制的研究［D］.長春:吉林大學，2005.

［5］ 施旭光，王沛堅.非線性回歸分析不同劑量配伍對烏頭湯中主要化學成分的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(1):55-58.

［6］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:37.