大孔樹脂對紅心蘿卜花色苷的純化

董周永，阿 嘎，趙國建，王笑丹，閆琳娜

大孔樹脂對紅心蘿卜花色苷的純化

董周永1，阿 嘎1，趙國建2，王笑丹1，閆琳娜1

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022；2.山西師范大學(xué)食品科學(xué)與工程系，山西 臨汾 041000)

比較6種大孔吸附樹脂對紅心蘿卜花色苷的吸附解吸效果，研究AB-8型大孔樹脂對紅心蘿卜花色苷的吸附與解吸條件。結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂是純化紅心蘿卜花色苷較適合的樹脂類型；紅心蘿卜花色苷在AB-8型樹脂上的吸附平衡時間4h，吸附最適溫度20℃，花色苷溶液的最適吸附pH3.0，解吸時宜選用75%乙醇溶液。經(jīng)純化后的蘿卜花色苷為紫黑色粉末，色價為47.8，是純化前的12倍。

紅心蘿卜；花色苷；純化；大孔樹脂

紅心蘿卜(Raphanus sativus L.)系十字花科作物，其肉質(zhì)根中含有豐富的花色苷和類黃酮物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)保健價值。大量研究表明，果蔬中的花色苷具有較強(qiáng)的清除自由基[1-3]、抗氧化[4-6]、抗癌[7-9]、預(yù)防心血管疾病[10]、減肥[11]等多種生理功能。因此，從果蔬中提取天然的花色苷類色素物質(zhì)已經(jīng)成為目前的研究熱點之一。由于大孔樹脂分離純化與傳統(tǒng)純化工藝相比，具有工藝簡單、效率高、生產(chǎn)成本低、再生方便等諸多優(yōu)點，已經(jīng)成為當(dāng)前分離純化天然產(chǎn)物的主流方法[12]。目前有關(guān)花色苷類物質(zhì)的分離純化已有較多的研究報道，但蘿卜花色苷純化的研究卻鮮見報道。為此本實驗比較色素純化常用的6種大孔樹脂對紅心蘿卜花色苷的吸附分離效果，從中篩選出較為合適的紅心蘿卜花色苷分離純化樹脂類型，并對其吸附解吸性能進(jìn)行研究，以期為紅心蘿卜花色苷類天然抗氧化物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

表1 6種大孔樹脂的物理參數(shù)Table 1 Physical parameters of 6 kinds of macroporous resins

紅心蘿卜(青皮紅心蘿卜) 長春市磐石路綜合市場。

大孔樹脂：HPD-700、HPD-722、HPD-100、HPD-80大孔樹脂 滄州寶恩化工有限公司；AB-8、D-101大孔樹脂 天津市海光化工有限公司。具體型號及物理參數(shù)見表1。

NaOH、HCl、乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

TDL-4A型離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；JA3003A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 紅心蘿卜花色苷提取液的制備

1.2.1.1 供試液的制備

新鮮紅心蘿卜洗凈，去皮，蘿卜果肉破碎。加入3倍體積60%乙醇溶液，用2mol/L鹽酸調(diào)其pH值至3.5，在60℃浸提3h后過濾，收集濾液，于50℃下減壓濃縮，冷藏備用。

1.2.1.2 紅心蘿卜花色苷提取液吸收光譜的測定

紅心蘿卜花色苷溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用2mol/L鹽酸調(diào)其pH值至3.5，用紫外-可見分光光度計對其在200～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定蘿卜花色苷的最大吸收峰。

1.2.2 樹脂類型的篩選

1.2.2.1 樹脂預(yù)處理

6種大孔樹脂用蒸餾水洗凈，分別在燒杯內(nèi)加入高于樹脂層10cm無水乙醇浸泡24h，充分溶脹，用無水乙醇淋洗直至洗出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象為止，再用蒸餾水洗至無醇，濾出樹脂。

1.2.2.2 樹脂吸附率和解析率的測定

準(zhǔn)確稱取6種預(yù)處理過的樹脂各1g，置于250mL具塞磨口三角瓶中。準(zhǔn)確量取pH3.5花色苷溶液100mL，于508nm波長處測其吸光度(A1)。然后將其分別加入到三角瓶中，置恒溫振蕩器上于30℃振蕩24h，充分吸附后，過濾，測濾液的吸光度(A2)。將濾出的樹脂加入到100mL、70%乙醇溶液中，置振蕩器上于60℃振蕩24h，充分解吸后過濾，測濾液的吸光度(Ak)，將Ak轉(zhuǎn)化成同質(zhì)量濃度時水溶液對應(yīng)的吸光度(A3)，計算各樹脂的吸附率(α)和解吸率(β)。

1.2.3 大孔樹脂對蘿卜花色苷的吸附性能

1.2.3.1 溫度對大孔樹脂吸附效果的影響

準(zhǔn)確稱取0.5g經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂，置于帶塞錐形瓶中，各加入50mL、pH3.0花色苷溶液(A508nm＝0.910)，于不同溫度下100r/min振蕩吸附，測定上清液508nm處的吸光度，作吸光度隨時間的變化曲線，確定溫度對樹脂吸附性能的影響。

1.2.3.2 紅心蘿卜花色苷在AB-8上的吸附平衡時間

準(zhǔn)確稱量0.5g經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂，置于帶塞錐形瓶中，各加入50mL、pH3.0花色苷溶液(A508nm＝0.910)，于20℃恒溫振蕩吸附，每隔1h取上清液測定吸光度A508nm，連續(xù)測定6h，作吸光度隨時間的變化曲線，確定紅心蘿卜花色苷在AB-8上吸附平衡時間。

1.2.3.3 pH值對大孔樹脂吸附效果的影響

用2mol/L鹽酸將蘿卜花色苷溶液調(diào)配至不同pH值，加入一定量經(jīng)活化的樹脂于室溫下靜置吸附4h后，測上清液吸光度，并計算樹脂的吸附率，確定吸附最佳pH值。

1.2.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

稱取1g已飽和吸附花色苷的樹脂置于三角瓶中，分別加入pH3.0不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液50mL，恒溫振蕩器100r/min振蕩1h后，于508nm波長處測定各溶液的吸光度，以吸光度表示花色苷的解吸量。

1.2.5 AB-8對紅心蘿卜花色苷的純化

將處理好的AB-8大孔樹脂濕法裝柱(1.5cm× 30cm)，將已制備的花色苷的粗提液用蒸餾水稀釋3倍，以10mL/min的流速通過層析柱至吸附達(dá)飽和，再以蒸餾水洗脫樹脂至流出液無混濁現(xiàn)象，然后以75%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，于50℃下減壓濃縮得深紫紅色漿狀物質(zhì)，干燥得到粉末狀固體。

1.2.6 紅心蘿卜花色苷的色價測定[13]

精確稱取0.10g花色苷提取物，用pH3.0檸檬酸緩沖液定容至100mL，稀釋一定倍數(shù)，在508nm處測定其吸光度，并計算色價

式中：A為樣品溶液的吸光度；r為測定吸光度時所吸樣品的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅心蘿卜花色苷提取液光譜掃描曲線

在200～800nm波長范圍內(nèi)對紅心蘿卜花色苷提取液進(jìn)行掃描，光譜掃描曲線如圖1所示。

圖1 紅心蘿卜花色苷吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of anthocyanins from red-core radish

從圖1可以看出，在紫外吸收光區(qū)有多個吸收峰，這可能是由于提取液中含有其他雜質(zhì)所致；在可見光區(qū)508nm波長處有一個非常明顯的吸收峰出現(xiàn)，這與資料基本相符[14]，所以本實驗采用508nm作為檢測波長。

2.2 最佳吸附樹脂的確定

表2 大孔樹脂對紅心蘿卜花色苷的吸附及解吸性能Table 2 Adsorption and desorption properties of macroporous resin towards anthocyanins from red-core radish

本研究選用色素純化常用的6種大孔樹脂對蘿卜花色苷進(jìn)行純化，數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計采用DPS v6.55軟件包進(jìn)行處理，結(jié)果以(x±s)表示(表2)。數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析，各型號樹脂間的兩兩比較采用LSD法。結(jié)果表明，6種樹脂的吸附率除HPD-722和D-101之間不顯著外，其余各樹脂間均達(dá)到極顯著差異(P＜0.01)。而解吸率除HPD-100與D-101差異不顯著外，其他各組間差異也均達(dá)到極顯著差異(P＜0.01)。由表2可知，不同型號的樹脂對花色苷的吸附程度不同，吸附率最大的是HPD-100，其次為AB-8，HPD-700的吸附率最低。解吸附率最大為HPD-700，其次為AB-8。這可能是由于花色苷類物質(zhì)屬弱極性化合物，但又有一定的極性和親水性，因而有利于弱極性或非極性樹脂的吸附。此外，其吸附能力大小還與比表面積等關(guān)系密切。同時，解吸率也是衡量大孔樹脂分離天然產(chǎn)物的重要技術(shù)參數(shù)之一。綜合吸附率和解吸率兩個參數(shù)，認(rèn)為AB-8型大孔吸附樹脂對蘿卜花色苷具有較好的吸附效果，故確定AB-8為本實驗的最佳樹脂。

2.3 溫度對AB-8樹脂吸附效果的影響

花色苷類物質(zhì)在低溫下的穩(wěn)定性較好，故本實驗只研究了20～60℃之間溫度對AB-8樹脂吸附效果的影響。

圖2 溫度對AB-8樹脂吸附效果的影響Fig.2 Effect of temperature on adsorption efficiency of resin AB-8

由圖2可知，溫度越高，紅心蘿卜花色苷的吸光度下降越快。這可能由于紅心蘿卜花色苷在AB-8大孔吸附樹脂上的吸附是靠分子間作用力，屬于物理吸附。溫度升高，有效成分在樹脂上的吸附作用降低，在溶液中的溶解度增大，致使花色苷在大孔吸附樹脂上的吸附速度和吸附量降低，因此，在吸附階段，以20℃作為吸附溫度較合適。

2.4 紅心蘿卜花色苷在AB-8上吸附平衡時間

圖3 AB-8大孔樹脂對紅心蘿卜花色苷隨時間的吸附趨勢線Fig.3 Adsorption curve of resin AB-8 towards anthocyanins from red-core radish

圖3 為AB-8樹脂對花色苷吸附過程中花色苷溶液的吸光度隨時間的變化規(guī)律。從圖3可以看出，在吸附起始階段花色苷溶液的吸光度下降迅速，2h后下降速度趨于緩慢，4h后吸光度基本不變。這說明在起始階段AB-8樹脂對花色苷的吸附率增加較快，但隨著時間的延長大孔樹脂在單位時間內(nèi)的吸附量逐漸減小，吸附逐漸趨于飽和，在4h時吸附基本達(dá)到平衡，吸附率不再增加。

2.5 pH值對AB-8樹脂吸附效果的影響

圖4 不同pH值條件下AB-8大孔樹脂對花色苷的吸附效果Fig.4 Adsorption capacity of resin AB-8 towards anthocyanin from red-core radish under various pH conditions

溶液pH值對花色苷的結(jié)構(gòu)與顏色影響很大，由于花色苷類物質(zhì)在酸性條件下比較穩(wěn)定，故本實驗只測定pH2.0～6.0時AB-8樹脂的吸附能力。由圖4可知，當(dāng)pH3.0時吸附率最高，之后隨pH值的增加吸附率逐漸下降。這可能是由于花色苷在酸性條件下主要以穩(wěn)定的黃烊鹽形式存在，而隨著pH值的逐漸增加花色苷存在的4種結(jié)構(gòu)形式的比例不同[15-16]而造成極性的差異，從而影響了吸附量。所以調(diào)pH3.0進(jìn)行吸附，效果較佳。2.6乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8樹脂解吸率的影響

洗脫劑具有使大孔樹脂溶脹、減弱被吸附物質(zhì)與樹脂之間吸附力的作用，并可溶解被吸附物質(zhì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)對樹脂吸附花色苷的洗脫效果影響較大，本研究進(jìn)行不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的洗脫效果實驗。當(dāng)樹脂吸附紅心蘿卜花色苷溶液至上清液吸光度不變時，認(rèn)為樹脂已吸附飽和。用蒸餾水分別清洗吸附飽和的樹脂后，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行靜態(tài)洗脫，結(jié)果如圖5所示。在測定前將各洗脫液調(diào)整至相同乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值，以減少因花色苷在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)和酸堿度條件下的吸收誤差。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸效果的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency

由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)上升，溶液的吸光度也隨著增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)75%時，吸光度達(dá)到最高，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過75%時，溶液的吸光度又逐漸變小。乙醇體積分?jǐn)?shù)過高或過低，解吸效果都會下降。溶液的吸光度越高，說明解吸效果越好。因此選用75%乙醇作為洗脫劑。

2.7 純化前后紅心蘿卜花色苷的色價比較

表3 純化前后花色苷色價的比較Table 3 Comparison on color value of anthocyanins before and after purification

按1.2.1.1節(jié)方法，紅心蘿卜花色苷提取液經(jīng)減壓濃縮、干燥后得到的花色苷粗提物為紫黑色膏狀物，由于含有較多的單糖及其他脂溶性雜質(zhì)，純度較低且容易吸潮。而經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的蘿卜花色苷為紫黑色粉末，按1.2.6節(jié)方法測定其色價，其值為47.8，是純化前的12倍，說明采用AB-8大孔樹脂能有效純化紅心蘿卜花色苷。

3 結(jié) 論

AB-8型大孔樹脂是分離純化蘿卜花色苷較為適宜的樹脂類型。其對蘿卜花色苷吸附平衡時間為4h，吸附最適溫度20℃，最適吸附pH3.0，解吸時宜選用75%乙醇溶液。經(jīng)純化后的蘿卜花色苷為紫黑色粉末，其色價為47.8，是純化前的12倍。

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Purification of Anthocyanins from Red-core Radish by Macroporous Resin

DONG Zhou-yong1，A Ga1，ZHAO Guo-jian2，WANG Xiao-dan1，YAN Lin-na1
(1. College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China；2. Department of Food Science and Engineering, Shanxi Normal University, Linfen 041000, China)

The adsorption and desorption effects of 6 kinds of macroporous resins on anthocyanins from red-core radish were compared. The adsorption and desorption properties of resin AB-8 on anthocyanins from red-core radish were further investigated. Results indicated that the adsorption equilibrium time of anthocyanins on resin AB-8 was 4 h. The highest adsorption capacity of resin AB-8 towards anthocyanins from red-core radish was achieved under the conditions of pH 3 and 20 ℃. In addition, 75% ethanol could provide the best desorption effect on anthocyanins from resin AB-8. The purified anthocyanins obtained under the optimal conditions were purple dark powder with color value of 47.8, which exhibited 12-fold enhancement compared with the color value of anthocyanins before purification.

red-core radish；anthocyanins；purification；macroporous resin

TS209

A

1002-6630(2011)04-0021-04

2010-04-19

吉林大學(xué)青年教師科研啟動基金項目(450080011100)

董周永(1982—)，男，講師，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工及其功能性成分研究。

E-mail：dongzhouyong3421@163.com