β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖工藝優(yōu)化

廖春龍，印遇龍,3，阮 征,*，文紅艷

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031；3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125)

β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖工藝優(yōu)化

廖春龍1,2，印遇龍1,2,3，阮 征1,2,*，文紅艷1,2

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330031；3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125)

目的：確定β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖的最佳工藝條件。方法：以蔗糖和乳糖為底物，利用β-呋喃果糖苷酶粗酶液合成低聚乳果糖，通過單因素和Box-Behnken試驗，對酶法合成工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到酶法合成低聚乳果糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳工藝條件為反應(yīng)時間22.77h、pH7.0、反應(yīng)溫度35.0℃、底物質(zhì)量濃度20.0g/100mL、底物與酶的體積比1:1，低聚乳果糖含量為22.70%。結(jié)論：Box-Behnken結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化果糖苷酶法合成低聚乳果糖工藝，模型可靠，方法可行。

低聚乳果糖；β-呋喃果糖苷酶；Box-Behnken試驗設(shè)計；響應(yīng)面

低聚乳果糖(lactosucrose, LS)，化學(xué)名為O-β-D-galactopyranosyl-(1 →2)-β-D-fructofuranoside，低聚乳果糖是以蔗糖和乳糖為底物，經(jīng)節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)產(chǎn)生的β-呋喃果糖苷酶的作用生成的。β-呋喃果糖苷酶是一種胞外酶，由節(jié)桿菌發(fā)酵獲得，它具有水解活力和果糖基轉(zhuǎn)移活力，能將蔗糖水解成葡萄糖和果糖基，并通過轉(zhuǎn)移活力將果糖基轉(zhuǎn)移到乳糖的還原性末端C1原子上，得到低聚乳果糖[1-2]。

目前，低聚乳果糖生理功能的研究主要集中在作用機(jī)理、基因代謝調(diào)控以及其在醫(yī)用保健方面的價值等方面[3-6]。低聚乳果糖很難被人唾液中的消化酶、胃液及小腸黏膜中的酶消化水解，幾乎不被分解直達(dá)大腸，能量值極低，很少被轉(zhuǎn)化為脂肪，具有降血脂、降低膽固醇等功效。研究發(fā)現(xiàn)[7]每天攝入5g低聚乳果糖，糞便中雙歧桿菌數(shù)會有顯著增加。研究表明低聚乳果糖可以改變腸道微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道的免疫功能[8]。由于能調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的關(guān)系，低聚乳果糖對治療慢性腸炎有一定效果[9]。低聚乳果糖經(jīng)過腸道微生物代謝為乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，可使得腸道內(nèi)的pH值下降，從而抑制了腸道內(nèi)腐敗微生物和病源微生物的生長[10]?；诘途廴楣堑纳鲜鰩追N生理功能，服用一定量的低聚乳果糖不僅能夠調(diào)整腸道菌群，而且可以降低某些疾病發(fā)生的風(fēng)險性。

圖1 低聚乳果糖的生成反應(yīng)Fig.1 Reaction mechanism for lactosucrose synthesis

目前，國內(nèi)的低聚糖生產(chǎn)廠家總的年產(chǎn)能大約為10萬噸左右，其中主要種類為低聚異麥芽糖和低聚果糖，而我國2011年低聚糖產(chǎn)品的年需求量將達(dá)20萬噸以上，市場缺口比較大。由于我國低聚糖的種類和產(chǎn)能都與國外存在較大的差距，所以研究開發(fā)新型的低聚糖及實現(xiàn)其工業(yè)化具有重要的意義。低聚乳果糖的產(chǎn)業(yè)化在國內(nèi)一直未見報道，原因是在生產(chǎn)中酶的活力和糖的純化制約了其在國內(nèi)的發(fā)展。隨著人們保健意識的日益增強(qiáng)和食品工業(yè)的發(fā)展，各種新型功能性食品添加劑的市場需求越來越大，作為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ牡途廴楣堑男枨笕笨谝矊⒃絹碓酱?，而酶法合成低聚乳果糖是唯一能解決這個問題的方法，因此低聚乳果糖酶法合成技術(shù)已成為急待解決的問題。

本實驗擬通過單因素和Box-Behnken試驗設(shè)計，對酶法合成工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，以期獲得酶法合成低聚乳果糖的最佳工藝參數(shù)，為低聚乳果糖的中試和生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種(Arthrobacter sp. 10138) 中國普通微生物菌種保藏管理中心；β-呋喃果糖苷酶粗酶液(酶活250U/mL)實驗室自制；低聚乳果糖標(biāo)準(zhǔn)樣 日本W(wǎng)AKO有限公司；乙腈(色譜純) 美國Tedia公司；蔗糖、乳糖均為分析純；二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-CA水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市榮華儀器有限公司；1200高效液相色譜儀(配有美國Softa Model 300s ELSD檢測器) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

菌種活化后按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、pH7.0、110r/min培養(yǎng)24h，裝液量為500mL發(fā)酵瓶裝200mL。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液以4000r/min離心20min，收集上清液置于－20℃冰柜中放置1d，再取出解凍，使沒有離心干凈的節(jié)桿菌因溶脹作用而失活。經(jīng)過酶活測定，酶活為250U/mL。一個酶活力單位定義為在pH7.0條件下，將3mL粗酶液和3mL糖液(含20g/100mL蔗糖和乳糖)于37℃反應(yīng)24h，每分鐘產(chǎn)生10-9mol低聚乳果糖的量。

1.3.2 酶法合成低聚乳果糖

乳糖蔗糖混合液與酶混合，考察底物質(zhì)量濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH值、酶用量、反應(yīng)溫度5因素對低聚乳果糖得率的影響，用單因素試驗得出水平范圍，再用Box-Behnken設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面分析確定找到最佳酶法合成條件。

1.4 檢測方法

采用HPLC-ELSD法對低聚乳果糖含量進(jìn)行測定。HPLC色譜條件：色譜柱：Kromasil氨基柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水(75:25)；流速：1mL/min；柱溫：30℃；漂移管溫度：70℃；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚乳果糖的成分分析

微生物酶法合成的低聚乳果糖成分比較復(fù)雜，主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚乳果糖，低聚乳果糖的液相色譜圖如圖2所示。

圖2 低聚乳果糖的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of lactosucrose synthesized under the catalysis ofβ-fructofuranoside

2.2 底物質(zhì)量濃度對LS合成的影響

以等質(zhì)量混合乳糖和蔗糖為底物，取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的底物混合液3mL，與3mL粗酶液混合，底物pH7.0，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時間為16h，混合后底物質(zhì)量濃度水平選擇10、20、30、40、50、60g/100mL。

由圖3可以看出，底物質(zhì)量濃度的變化對LS的得率影響不大，理論上增加底物質(zhì)量濃度可以降低整個體系的水分活度，可以增加酶的轉(zhuǎn)移活性，但是增加底物質(zhì)量濃度，底物的黏度也會隨之增加，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，所以在實際的操作過程中，底物質(zhì)量濃度選擇20g/100mL是比較符合實驗要求的。

圖3 底物質(zhì)量濃度對LS合成的影響Fig.3 Effect of total concentration of two sugars in aqueous solution on lactosucrose synthesis

2.3 反應(yīng)時間對LS合成的影響

乳糖蔗糖混合液3mL與3mL粗酶液混合，底物質(zhì)量濃度20g/100mL，底物pH7.0，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時間水平為8、16、24、32、40、4 8h。

圖4 反應(yīng)時間對LS合成的影響Fig.4 Effect of reaction time on lactosucrose synthesis

當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度20g/100mL、反應(yīng)時間24h，LS最大得率為20.91%，當(dāng)反應(yīng)時間繼續(xù)增加時，低聚乳果糖含量反而會降低。LS酶法合成是一個可逆反應(yīng)，隨著反應(yīng)時間的增加，水解產(chǎn)物葡萄糖的增加會抑制合成反應(yīng)的正向進(jìn)行，LS水解，含量降低。

2.4 底物pH值對LS合成的影響

圖5 pH值對LS合成的影響Fig.5 Effect of pH on lactosucrose synthesis

乳糖蔗糖混合液3mL與3mL粗酶液混合，底物質(zhì)量濃度20g/100mL，反應(yīng)時間24h，反應(yīng)溫度37℃，底物 pH5.7、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

由圖5可得，底物pH7.0時，LS含量為20.51%，說明底物pH7.0時，酶的轉(zhuǎn)移活力最高，pH值過高或者過低都會影響酶的轉(zhuǎn)移活力。

2.5 酶用量對LS合成的影響

配制60%混合糖液，取3mL，分別加入0.5、1、2、3、4、5mL粗酶液，然后再加入PBS緩沖液(0.05mol/L、pH7.0)至9mL，確保體系的底物質(zhì)量濃度20g/100mL，反應(yīng)時間24h，反應(yīng)溫度37℃，底物pH7.0，考察酶用量對LS合成的影響。

圖6 酶用量對LS合成的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on lactosucrose synthesis

酶用量過低，LS含量也低，究其原因是因為酶濃度過低，底物與酶的結(jié)合不充分，隨著酶用量的增加，LS含量會急劇增加，當(dāng)酶用量為3mL的時候，LS含量為20.32%，隨著酶用量的繼續(xù)增加，LS的含量反而有所降低，分析其原因可能是因為酶所具有的水解活性水解低聚乳果糖所造成的，所以3mL混合糖液中酶用量為3mL，即混合糖液與酶用量體積比為1:1為最佳。

2.6 反應(yīng)溫度對LS合成的影響

乳糖蔗糖混合液3mL與3mL粗酶液混合，底物質(zhì)量濃度20g/100mL，反應(yīng)時間24h，底物pH7.0，反應(yīng)溫度水平選擇為27、32、37、42、47℃。

圖7 反應(yīng)溫度對LS合成的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on lactosucrose synthesis

溫度過低時，則酶的活性低，故合成的LS含量也低，在32～37℃的時候，LS含量比較高，在32℃時，LS含量達(dá)到21.77%。隨著溫度的再度增加，酶活降低，LS合成的量急劇下降。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化LS合成工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇反應(yīng)時間、底物p H值、反應(yīng)溫度這3個因素設(shè)計試驗，用響應(yīng)面對合成工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖響應(yīng)面試驗因素水平編碼表Table 1 Coded values and corresponding actual values of variables in response surface analysis

表2 β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results for response surface analysis

利用SAS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到LS得率與反應(yīng)時間、底物pH值、反應(yīng)溫度的二次多項回歸模型為Y=22.54667－0.14875X1＋0.2575X2＋0.46375X3－1.062083X12－1.34X1X2－1.1575X1X3－2.739583X22－1.98X2X3－2.817083X32，由表3可知，X1X2、X1X3項顯著，、X2X3、項極顯著，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系即回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9554，這也表明響應(yīng)值的變化有95.54%來自有所選變量(反應(yīng)時間、底物pH值、反應(yīng)溫度)，平方項極顯著、交互項顯著、模型極顯著，失擬項不顯著，表明該方程對試驗擬合較好，可以用于LS酶法合成的預(yù)測。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of the predicative regression model for the content of lactosucrose in reaction product

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從這些三維圖可以很直觀的看出各參數(shù)和最佳參數(shù)之間的相互作用。

圖8 Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面Fig.8 Response surface polt of Y=f(X1,X2)

圖9 Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面Fig.9 Response surface polt of Y=f(X1,X3)

圖10 Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面Fig.10 Response surface polt of Y=f(X2,X3)

通過運(yùn)行所編寫程序得到最佳工藝參數(shù)的臨界值，如表6所示，反應(yīng)時間22.77h、pH7.03、反應(yīng)溫度35.48℃，在最佳工藝條件下LS預(yù)測值22.59%，由于在實際操作過程中，條件控制達(dá)不到如此精確，故取最佳反應(yīng)時間22.77h、pH7.0、反應(yīng)溫度35℃，在此條件下的實際值為(22.70±0.2)%(重復(fù)3次)，說明該模型可靠。

表4 臨界值Table 4 Critical values of various reaction conditions

3 討論與結(jié)論

中心組合(CCD)設(shè)計和Box-Behnken設(shè)計均可以擬合一個二次完全析因設(shè)計的響應(yīng)面設(shè)計，也是目前較為常用的響應(yīng)面法。作為3水平部分因素設(shè)計的Box-Behnken設(shè)計是相對于中心組合設(shè)計的較優(yōu)選擇。通過B ox-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面分析，利用SAS軟件，優(yōu)化低聚乳果糖的酶法合成工藝參數(shù)(底物質(zhì)量濃度、酶用量、反應(yīng)時間、底物p H值、反應(yīng)溫度)，最終得到最佳工藝參數(shù)為底物質(zhì)量濃度20g/100mL、底物與酶的體積比1:1、反應(yīng)時間22.77h、pH7.0、反應(yīng)溫度35℃，在此條件下酶法合成低聚乳果糖含量為22.7%，取得較理想效果，該實驗對酶法合成低聚乳果糖的工業(yè)化有一定的指導(dǎo)作用。

朱桂蘭等[11]對低聚乳果糖的酶法合成進(jìn)行研究，反應(yīng)條件為等體積的粗酶液和糖液(含40%的蔗糖和乳糖)，pH6.5于37℃反應(yīng)24h，得到低聚乳果糖含量為16.38%。Han等[12]也對該反應(yīng)進(jìn)行了研究，得到的最佳工藝參數(shù)是23℃、pH7.0、底物質(zhì)量濃度36g/100mL(蔗糖18%、乳糖18%)，得到的低聚乳果糖含量28.50%，此結(jié)果與本實驗的結(jié)果相比較高，可能是因為酶有所不同，Han等[12]使用的酶為果聚糖蔗糖酶(levansucrase)。

由于在合成低聚乳果糖的過程中，會存在副反應(yīng)和逆反應(yīng)，即β-呋喃果糖苷酶會水解蔗糖產(chǎn)生葡萄糖和水解低聚乳果糖，會抑制合成反應(yīng)的進(jìn)行，如果想使反應(yīng)產(chǎn)生更多的低聚乳果糖，就必須使用一定的手段移除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的葡萄糖，否則很難將低聚乳果糖的含量提高。如利用酵母消耗反應(yīng)過程中的葡萄糖，利用流化床移除葡萄糖，或者利用雙酶法等方法提高酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的低聚乳果糖含量，再通過過膜、離子交換層析等方法來提高低聚乳果糖的含量[13-16]，而國內(nèi)這些技術(shù)在低聚乳果糖開發(fā)利用上的研究較少，是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

[1] FUJITA K, HARA K, HASHIMOTO H, et al. Purification and some properties of β-fructofuranosidase from Arthrobacter sp. K-1[J]. Agric Biol Chem, 1990, 54(4): 913-919.

[2] FUJITA K, HARA K, HASHIMOTO H, et al. Transfructosylation catalyzed by β-fructofuranosidase from Arthrobacter sp.K-1[J]. Agric Biol Chem, 1990, 54(10): 2655-2661.

[3] KISHINO E, NORII M, FUJITA K, et al. Enhancement by lactosucrose of the calcium absorption from the intestine in growing rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(6): 1485-1488.

[4] TANIGUCHI Y, MIZOTE A, KOHNO K, et al. Effects of dietary lactosucrose (4G-β-D-galactosylsucrose) on the IgE response in mice[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2007, 71(11): 2766-2773.

[5] AKIKO M, YOSHIFUMI T, YASUHIKO T, et al. Lactosucrose inhibits body fat accumulation in rats by decreasing intestinal lipid absorption[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(3): 582-587.

[6] NAOKO H, YOSHIAKI S, HIROMI T. Effect of post-prandial posture on orocecal transit time and digestion of milk lactose in humans[J].Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science,2004, 23(3): 75-80.

[7] OHKUSA T, OZAKI Y, SATO C, et al. Long-term ingestion of lactosucrose increases Bifidobacterium sp. in human fecal flora[J].Digestion, 1995, 56 (5): 415-420.

[8] KEIKO H, MAYUMI K, TAKEO S, et al. Effect of dietary lactosucrose(4G-β-D-galactosylsucrose) on the intestinal immune functions in mice[J]. The Japanese Society of Applied Glycoscience, 2007, 54(3): 169-172.

[9] TERAMOTO F, ROKUTAN K, KAWAKAMI Y. Effect of 4G-β-D-galactosylsucrose (lactosucrose) on fecal microflora in patients with chronic inflammatory bowel disease[J]. J Gastroenterot, 1996, 31(1): 33-39.

[10] RUPEREZ P. Oligosacaridos bifidogenicos[J]. Food Science and Technology International, 1998, 4(4): 237-243.

[11] 朱桂蘭, 童群義. 節(jié)桿菌10137產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶條件及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報, 2004, 23(5): 78-81.

[12] HAN W C, BYUN S H, KIM M H, et al. Production of lactosucrose from sucrose and lactose by a levansucras from zymomonas mobilis[J].J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(10): 1153-1160.

[13] 岡部浩幸, 阿賀創(chuàng), 久保田倫夫, 等. 乳蔗糖高含量糖及其制造方法和用途: 中國, CN1946853A[P]. 2007-04-11.

[14] 村上和史, 伊藤哲也, 藤田孝輝, 等. 結(jié)晶乳果寡糖或含該糖的含蜜結(jié)晶及其用途: 中國, CN1993374A[P]. 2007-07-04.

[15] KAWASE M, PILGRIM A, ARAKI T, et al. Lactosucrose production using a simulated moving bed reactor[J]. Chemical Engineering Science,2001, 56(2): 453-458.

[16] PILGRIM A, KAWASE M, MATSUDA F, et al. Modeling of the simulated moving-bed reactor for the enzyme-catalyzed production of lactosucrose[J]. Chemical Engineering Science, 2006, 61(2): 353-362.

Process Optimization for Beta-fructofuranoside-catalyzed Synthesis of Lactosucrose

LIAO Chun-long1,2，YIN Yu-long1,2,3，RUAN Zheng1,2,*，WEN Hong-yan1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；
2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；
3. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China)

Objective: To obtain the optimum process conditions for the synthesis of lactosucrose under the catalysis of βfructofuranoside. Methods: Lactosucrose was prepared from lactose as an acceptor and sucrose as a fructosyl donor by a fructose-transferring enzyme, β-fructofuranoside derived from Arthrobacter sp.10138. The process was optimized by Box-Behnken experimental design followed by response surface analysis. Results: Adding the same volume of β-fructofuranoside solution to a mixture of lactose and sucrose in equal proportion by weight in aqueous solution to catalyze the reaction between the two sugars for 22.77 h at 35.0 ℃ provided optimum synthesis of lactosucrose, and the content of lactosucrose in reaction product was 22.70%. Conclusion: Combined use of Box-Behnken experimental design and response surface methodology has the feasibility to be used as a mathematical approach to optimize the synthesis process for lactosucrose, and the established model is reliable in predicting the content of lactosucrose in reaction product.

lactosucrose；β-fructofuranoside；Box-Behnken experimental design；response surface methodology

TS247

A

1002-6630(2011)04-0102-05

2010-04-15

南昌大學(xué)“贛江學(xué)者獎勵計劃”項目；中國博士后科學(xué)基金資助項目(20080440166)

廖春龍(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與碳水化合物利用。E-mail：lclong0213@126.com

*通信作者：阮征(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為食物營養(yǎng)調(diào)控與糖工程。E-mail：ezruan@yahoo.com