響應(yīng)曲面法優(yōu)化尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸的工藝

張海祥，方婷婷，潘文娟，廖愛美,2，魏兆軍,*

響應(yīng)曲面法優(yōu)化尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸的工藝

張海祥1，方婷婷1，潘文娟1，廖愛美1,2，魏兆軍1,*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥師范學(xué)院生命科學(xué)系，安徽 合肥 230061)

采用響應(yīng)曲面法對尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸工藝進行優(yōu)化。以α-亞麻酸純度為響應(yīng)值，溫度、尿素與脂肪酸比值、95%乙醇與脂肪酸比值和包合時間為試驗因素，進行中心組合試驗。結(jié)果表明，α-亞麻酸富集最優(yōu)工藝條件為溫度-8.27℃、尿素與脂肪酸比值3.39、95%乙醇與脂肪酸比值10.47、包合時間8.91h，α-亞麻酸純度達70.28%。尿素包合法是富集蠶蛹油α-亞麻酸有效的方法。

蠶蛹油；α-亞麻酸；尿素包合

α-亞麻酸(alpha-linolenic acid，ALA)為全順式十八碳-9,12,15-三烯酸，分子式為C18H30O2，是ε-3系列多不飽和脂肪酸，屬于必需脂肪酸，人體不能自身合成，需要從食物中補充。α-亞麻酸具有降血壓、降血脂、抗血栓、抗過敏的功效，能夠預(yù)防心血管疾病、增強免疫力、增長智力和延緩衰老，α-亞麻酸是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前體，如果缺乏會影響智力和視覺敏銳度[1-6]。蠶蛹油中不飽和脂肪酸含量達66.8%，其中α-亞麻酸含量27.99%，是一種優(yōu)質(zhì)的α-亞麻酸來源[7-9]。

由于大多數(shù)動植物中α-亞麻酸含量較低，而α-亞麻酸只有達到一定純度后才能表現(xiàn)出典型的生理活性，所以需要對其進行富集純化。目前，α-亞麻酸富集方法有硝酸銀絡(luò)合法、分子蒸餾和尿素包合法等方法。張海滿等[10]采用尿素包合法純化亞麻油中α-亞麻酸，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)由46.7%提高到87.3%，收率53.3%。楊克迪等[11]采用硝酸銀絡(luò)合萃取蠶蛹油α-亞麻酸酯，所得產(chǎn)品中α-亞麻酸酯純度達到97.9%，收率44.3%。李婷婷等[12]采用分子蒸餾技術(shù)富集獼猴桃籽油中α-亞麻酸，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到83.67%，四級分子蒸餾后α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到86.27%?？傮w來看，硝酸銀絡(luò)合法得到的亞麻酸純度高，但是硝酸銀價格昂貴，濃縮產(chǎn)品中有Ag+殘留；分子蒸餾工序簡單，效率較高，但設(shè)備投入較大，要得到高純度亞麻酸需要多級分子蒸餾，回收率變低[13]。尿素包合法具有成本低廉、工藝簡單、操作溫度低等優(yōu)點，是一種簡單有效的多不飽和脂肪酸富集方法。本研究利用從繅絲廠蠶蛹中提取的蠶蛹油為原料，采用響應(yīng)曲面方法對尿素包合富集α-亞麻酸進行工藝優(yōu)化，以期使蠶蛹油α-亞麻酸得到富集純化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹(繅絲后的下腳料) 安徽雙龍絲綢有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；EP2134C型分析天平 上海奧豪公司；Allegra 64R型離心機 美國貝特曼庫爾特有限公司；QP2010型GCMS分析儀 日本島津公司。

1.3 蠶蛹油提取及混合脂肪酸制備方法

繅絲廠下腳料蠶蛹烘干后粉碎，經(jīng)超臨界CO2萃取蠶蛹油。蠶蛹油提取工藝為萃取壓力324.5Pa、萃取溫度39.6℃、萃取時間131.2min、CO2流量19.3L/h，在此條件下出油率為29.73%[1]。

稱取200g蠶蛹油緩慢加入到1000mL 3.7%氫氧化鈉乙醇溶液中，60℃水浴攪拌皂化1h，靜置至室溫后加蒸餾水至溶液澄清，用濃鹽酸調(diào)溶液pH2～3，加入正己烷于分液漏斗中萃取兩次，靜置棄水層，蒸餾水水洗至中性，有機相用無水硫酸鈉脫水后60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷，即得混合脂肪酸[14]。

1.4 尿素包合富集α-亞麻酸工藝

按設(shè)定的比例將尿素和95%乙醇加入到250mL三角燒瓶中，尿素于80℃水浴中完全溶解后放入60℃水浴中，將混合脂肪酸在60℃水浴中預(yù)熱后取10g加入到三角燒瓶中，搖勻后在室溫下靜置20min后在設(shè)定溫度下進行包合反應(yīng)，一段時間后取出迅速抽濾，濾液用4mol/L鹽酸調(diào)pH2～3，正己烷萃取兩次，水洗至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到包合后脂肪酸。

1.5 氣相和質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析脂肪酸組分

取包合后脂肪酸20μL加入4mL H2SO4-CH3OH(1:7，V/V)溶液，放入恒溫振蕩搖床中，38℃、130r/min酯化12h，用正己烷萃取2次，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌多次，采用無水Na2SO4干燥，6000r/min離心20min后，取上清液進行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱DB-WAX(30m×0.25mm，0.25 μm)；程序升溫，初溫200℃，保持2min，3℃/min升溫至230℃，保持3min，進樣口溫度250℃，檢測器溫度260℃，載氣為高純氦(He)，流速1.5mL/min；進樣量1.0μL，分流比為50。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量70eV，接口溫度250℃，電子倍增器電壓1.1kV，掃描范圍20～800u[1]。

1.6 數(shù)據(jù)設(shè)計與統(tǒng)計分析

采用響應(yīng)曲面法(RSM)來優(yōu)化尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸工藝[1]，以溫度、尿素與脂肪酸比值、95%乙醇與脂肪酸比值、包合反應(yīng)時間為自變量，以α-亞麻酸純度為響應(yīng)值，響應(yīng)曲面設(shè)計中各變量的編碼和相對應(yīng)的非編碼值見表1。應(yīng)用SAS 9.2進行基于中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(CCRD)的響應(yīng)曲面設(shè)計，試驗共有31種組合，其中16(24)組二水平析因點試驗，8組星點試驗和7組中心點試驗，具體的試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。為了減少不必要的誤差，所有試驗按任意的順序進行，除中心點試驗(0，0，0，0)外，所有試驗重復(fù)3次。設(shè)該模型的二次多項方程為：

式中：Y為預(yù)測響應(yīng)值，即α-亞麻酸純度/%；β0、βi、βii、βij分別為常數(shù)、一次項、二次項和交互作用項系數(shù)。應(yīng)用SAS9.2軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，對其進行響應(yīng)曲面分析優(yōu)化，以獲得尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸的最佳工藝條件參數(shù)。

基于在前期單因素預(yù)試驗基礎(chǔ)上選擇響應(yīng)面設(shè)計因素水平，單因素試驗時，溫度0℃、尿素與脂肪酸比值3g/g、95%乙醇與脂肪酸比值14(mL/g)、包合反應(yīng)時間10h為較優(yōu)條件，因此，以這些值作為中心點的水平，具體因素水平見表1。

表1 尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸的響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table 1 Coded and corresponding actual levels of independent variables in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化尿素包合法富集蠶蛹油α-亞麻酸

中心組合試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3，模型的R2=85.76%，說明試驗數(shù)據(jù)很好地擬合了模型。對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到四元二次回歸方程為：

表2 尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

表4中心組合試驗結(jié)果回歸分析表明，X1、X2線性效應(yīng)及X12、X22顯著(P＜0.05)，根據(jù)方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗的結(jié)果，將差異不顯著的因素剔除后得到的回歸模型方程為：

表3 中心組合試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation for α-linolenic acid in urea inclusion compounds

表4 中心組合試驗結(jié)果回歸分析表Table 4 Significance test of each term of the regression equation for α-linolenic acid in urea inclusion compounds

在試驗水平范圍內(nèi)，利用響應(yīng)曲面得到的最優(yōu)工藝條件為溫度-8.27℃、尿素與脂肪酸比值3.39、95%乙醇與脂肪酸比值10.47、包合反應(yīng)時間8.91h，在此條件下α-亞麻酸純度70.28%。

圖1 溫度與尿素與脂肪酸比值的交互作用對α-亞麻酸純度的影響Fig.1 Three-dimensional response surface diagram for the interactive effects of reaction temperature and the ratio of urea to fatty acids on α-linolenic acid in urea inclusion compounds

由圖1可以看出，隨著溫度的降低和尿素用量的增多，α-亞麻酸純度先增加，增大到一定程度后開始減小，在溫度-10℃，尿素與脂肪酸比值為3左右，α-亞麻酸純度有最大值。

2.2 模型方程的驗證

利用響應(yīng)曲面優(yōu)化得到的工藝條件進行重復(fù)實驗，溫度-8.27℃、尿素與脂肪酸比值3.39、95%乙醇與脂肪酸比值10.47、包合反應(yīng)時間8.91h，在此條件下α-亞麻酸純度達70.42%，與預(yù)測值非常接近。對比尿素包合前后蠶蛹油脂肪酸的GC圖(圖2)及脂肪酸組分表(表5)，可以看出α-亞麻酸得到了很好的富集，尿素包合后不飽和脂肪酸含量達97.24%。

圖2 蠶蛹油脂肪酸GC圖(A)與尿素包合后脂肪酸GC圖(B)Fig.2 GC profiles of silkworm pupal oil before and after urea adduction fractionation

表5 包埋后蠶蛹油主要脂肪酸組分Table 5 Comparisons of main fatty acid constituents in silkworm pupal oil before and after urea adduction fractionation

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)曲面法對尿素包合富集蠶蛹油α-亞麻酸工藝進行優(yōu)化。分析結(jié)果表明，溫度和尿素與脂肪酸比值的線性效應(yīng)對α-亞麻酸純度的影響達到極顯著水平，一定范圍內(nèi)降低溫度，增加尿素用量都可以提高α-亞麻酸純度，得到數(shù)學(xué)模型：Y=-29.41-0.984X1＋48.42X2＋1.6X3-0.011X12-6.698X22。

α-亞麻酸富集最優(yōu)工藝條件為溫度-8.27℃、尿素與脂肪酸比值3.39、95%乙醇與脂肪酸比值10.47、包合反應(yīng)時間8.91h，α-亞麻酸純度達70.28%。

[1]WEI Zhaojun, LIAO Aimei, ZHANG Haixiang, et al. Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of silkworm pupal oil applying the response surface methodology[J]. Bioresour Technol, 2009, 100(18): 4214-4219.

[2]李加興, 李忠海, 劉飛, 等. α-亞麻酸的生理功能及其富集純化[J].食品與機械, 2009, 25(5): 172-177.

[3]馬養(yǎng)民, 杜小暉, 馮成亮. α-亞麻酸提取純化方法的研究進展[J]. 糧油加工, 2008(10): 69-72.

[4]龔雪龍, 司馬楊虎, 孫曉飛. 家蠶蛹脂肪酸成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2010, 36(1): 186-189.

[5]BEGG D P, SINCLAIR A J, STAHL L A, et a1. Hypertension induced by omega-3 polyunsaturated fatty acid deficiency is alleviated by alphalinolenic acid regardless of dietary source[J]. Hypertension Research, 2010, 33(8): 808-813．

[6]PEREIRA N R, FERRARESE O, MATSUSHITA M, et a1. Proximate composition and fatty acid profile of Bombyx mori L. chrysalis toast[J]. J Food Compost Anal, 2003, 16(4): 451-457．

[7]廖愛美 蠶蛹油的提取工藝優(yōu)化、組分分析及其功能評價[D]. 合肥:合肥工業(yè)大學(xué), 2009.

[8]魏兆軍, 姜紹通. 蠶食用化研究進展[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 592-596.

[9]魏兆軍, 廖愛美, 于力濤, 等. 家蠶蛹油提取工藝優(yōu)化研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(10): 248-251.

[10]張海滿, 劉福禎, 戴玲妹. 尿素包合法純化α-亞麻酸工藝研究: Ⅰ[J]. 中國油脂, 2001, 26(2): 41-44.

[11]楊克迪, 胡小明, 黃?；? 等. 硝酸銀絡(luò)合萃取蠶蛹油α-亞麻酸酯[J]. 中國油脂, 2008, 33(1): 30-32.

[12]李婷婷, 吳彩娥, 許克勇, 等. 分子蒸餾技術(shù)富集獼猴桃籽油中α-亞麻酸[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報, 2007, 38(5): 96-99.

[13]張四喜, 鄧樹海, 宋燕青, 等. 蠶蛹油α-亞麻酸的純化與氣相色譜含量測定方法研究[J]. 藥物分析雜志, 2007, 27(4): 535-538.

[14]毛多斌, 賈春曉, 金保全, 等. 省沽油種子油中脂肪酸的GC-MS分析[J]. 中國油脂, 2004, 29(3): 64-66.

Optimization of the Enrichment of Alpha-Linolenic Acid in Silkworm Pupal Oil by the Method of Urea Adduction Fractionation

ZHANG Hai-xiang1，F(xiàn)ANG Ting-ting1，PAN Wen-juan1，LIAO Ai-mei1,2，WEI Zhao-jun1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Department of Life Science, Hefei Normal University, Hefei 230061, China)

Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the enrichment of α-linolenic acid in silkworm pupal oil by the method of urea adduction fractionation. This optimization was carried out based on our previous investigations on the effects of four process parameters, namely reaction temperature and time, the ratio of urea to fatty acids, and the ratio of 95% ethanol to fatty acids on α-linolenic acid content in urea inclusion compounds by single factor method, and the results showed that the optimum levels of the four parameters were determined to be -8.27 ℃, 8.91 h, 3.39:1 and 10.47:1, respectively. Under the optimum conditions, the content of α-linolenic acid in urea inclusion compounds was up to 70.28%. Urea adduction fractionation is an effective method for the enrichment of α-linolenic acid.

silkworm pupal oil；α-linolenic acid；urea adduction fractionation

R284.1

A

1002-6630(2011)04-0074-04

2010-10-25

安徽省“十一五”科技攻關(guān)計劃項目(08010302149)；江蘇省“十一五”科技支撐計劃項目(農(nóng)業(yè)BE2009365)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才基金項目(NCET-07-0251)

張海祥(1980—)，男，碩士研究生，研究方向為功能食品和生物技術(shù)。E-mail：zhx105020@163.com

*通信作者：魏兆軍(1970—)，男，教授，博士，研究方向為功能食品。E-mail：zjwei@hfut.edu.cn