響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取檳榔原花青素工藝

陳 健，孫愛東*，高雪娟，潘 娜

響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取檳榔原花青素工藝

陳 健，孫愛東*，高雪娟，潘 娜

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

利用響應(yīng)面分析法(RSM)對檳榔原花青素的提取工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上選取試驗因素與水平，根據(jù)中心組合(Box-Behnken)試驗設(shè)計原理采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法對各個因素的顯著性和交互作用進行分析，結(jié)果表明：檳榔干原花青素提取的最佳工藝條件為超聲功率600W、超聲時間16min、料液比1:40(g/mL)、丙酮體積分?jǐn)?shù)81%，在此條件下，測定花青素提取率最高達到3.41%。

檳榔；原花青素；提??；響應(yīng)面法

原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物，其基本組成單位是黃烷-3-醇和黃烷-3,4-二醇[1]。經(jīng)多年藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)：原花青素對自由基有很強的捕捉消除能力，是一種很好的氧自由基清除劑，具有抑制紅細(xì)胞膜和低密度脂蛋白脂質(zhì)過氧化、防止血小板凝聚、防止心腦血管疾病等功能。目前在食品、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域已有所應(yīng)用，在歐美等國家享有“皮膚維生素”和“口服化妝品”的美譽[2]。

檳榔(Areca catechu L.)是棕櫚科植物的成熟種子，主產(chǎn)于我國海南、廣東、廣西、云南、福建和臺灣等省區(qū)，以及印度和馬來西亞等國。檳榔是我國四大南藥之一。醫(yī)學(xué)家李時珍在《本草綱目》中記載，檳榔具有“下水腫、通關(guān)節(jié)、健脾調(diào)中、治心痛積聚”等功效，以及治療青光眼和降血壓的效果[3]。檳榔是海南省熱帶作物中僅次于橡膠的第二大經(jīng)濟作物，也是海南省第二大支柱產(chǎn)業(yè)。然而，海南的檳榔主要被加工成檳榔干銷往內(nèi)地，基本上沒有對這一特色熱帶作物資源進行深加工。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，它與過去廣為使用的正交試驗設(shè)計法不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[5]。

目前，檳榔的研究主要集中在檳榔堿的提取上，檳榔內(nèi)的活性成分原花青素的研究未見相關(guān)報道[4]。本研究以海南檳榔果作為原料，對其中原花青素的提取工藝進行探討，并利用響應(yīng)面分析對提取參數(shù)進行優(yōu)化，為檳榔果的深度開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檳榔果采自海南省萬寧市；丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、鹽酸和硫酸亞鐵銨溶液均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP22100UV型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；RE252AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DK29821型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；DF204電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠；JAC-600超聲波中藥處理機 山東濟寧超聲電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檳榔原花青素的提取

將洗凈的檳榔于烘箱中60℃干燥24h，用粉碎機將干燥的檳榔干粉碎，過40目篩。精確稱取1.0g檳榔干粉末于100mL容量瓶中，按要求加入一定量的溶劑，在一定溫度下超聲波提取一定時間，減壓過濾，得到原花青素類物質(zhì)提取液。

1.3.2 檳榔原花青素的測定

本實驗采用正丁醇-鹽酸法測定檳榔中原花青素的含量。取萃取液加入100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。取上述溶液1mL于具塞試管中，依次加入6mL正丁醇-鹽酸(V/V=95:5)及0.2mL 2%硫酸亞鐵銨溶液(24g硫酸亞鐵銨溶于水，定容于1000mL)，搖勻后，在95℃的水浴中加熱40min，然后用自來水迅速冷卻。用1mL甲醇代替提取液重復(fù)以上操作，作為參比液。在540nm波長處測定其吸光度[6]，并計算原花青素的提取率。

式中：A為吸光度；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/mg；0.366為A在540nm波長處原花青素的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

精確稱取1.0g檳榔干粉末15份，分別以不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮、乙醇、甲醇水溶液作為提取劑，室溫下提取。

丙酮、甲醇、乙醇均為良好的提取溶劑，有研究表明，丙酮-水混合溶劑能顯著地提取更多原花青素[7]。丙酮、甲醇、乙醇水溶液對檳榔原花青素的提取效果見圖1。由圖1可知，丙酮水溶液的提取效果優(yōu)于其他二者，與上述結(jié)論一致。因此，選用丙酮作為檳榔中原花青素的提取溶劑。

圖1 不同溶劑對檳榔原花青素提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

2.2 超聲波提取檳榔原花青素的單因素試驗

以丙酮為提取劑，在其他條件一致的情況下，分析丙酮體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、超聲功率及超聲時間等因素對原花青素粗提液提取效果的影響。

2.2.1 丙酮體積分?jǐn)?shù)的確定

精確稱取1.0g檳榔干粉末5份，料液比1:40(g/mL)，在同一超聲功率、相同超聲時間下，考察不同的丙酮體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響。

圖2 丙酮不同體積分?jǐn)?shù)對檳榔原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of acetone concentartion on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

如圖2所示，隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率相應(yīng)增加，體積分?jǐn)?shù)為85%時提取效果最好，當(dāng)大于85%時，呈現(xiàn)下降趨勢。這有可能是由于增大了提取液的體積分?jǐn)?shù)，使原花青素的氧化速率加快，從而降低原花青素的提取率[8]。

2.2.2 提取溫度的確定

精確稱取1.0g檳榔干粉末5份、80%丙酮作為提取劑、料液比1:40(g/mL)，在同一超聲功率、相同超聲時間下，考察不同溫度對原花青素提取率的影響。

圖3 不同提取溫度對檳榔原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

如圖3所示，當(dāng)溫度低于35℃，隨著溫度的升高，溶劑提取率增加，但趨勢緩慢。當(dāng)溫度高于35℃，提取率反而下降?？紤]到溫度越高，丙酮揮發(fā)越大，影響溶劑與溶質(zhì)的傳質(zhì)，溶劑消耗嚴(yán)重，故選擇35℃作為提取的最適溫度[9]。

2.2.3 料液比的確定

準(zhǔn)確稱取1.0g檳榔干粉末5份、80%丙酮作為提取劑，在同一超聲功率、相同超聲時間下，考察不同的料液比對原花青素提取率的影響。

圖4 不同料液比對檳榔原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of the ratio of material to extraction solvent on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

如圖4所示，隨溶劑用量的增加，原花青素浸提量增加，但溶劑用量達到一定程度時，檳榔中的原花青素接近全部溶出，再增加溶劑用量不僅不能增加提取量，反而會增加生產(chǎn)成本。當(dāng)料液比為1:40時，原花青素的提取率基本達到最大值[10]。

2.2.4 超聲功率的確定

精確稱取1.0g檳榔干粉末5份、80%丙酮作為提取劑、料液比1:40(g/mL)，在相同時間下考察不同的超聲功率對原花青素得率的影響。

如圖5所示，隨著超聲功率的提高，原花青素提取率也提高，當(dāng)超聲功率為600W時原花青素提取率最高，但超聲功率過大反而引起原花青素提取率下降，說明超聲功率對原花青素提取率的影響是雙向性的，既有正效應(yīng)又有負(fù)效應(yīng)。試驗中應(yīng)避免超聲波功率過大而引起提取率下降，同時超聲功率升高會引起溫度升高。綜合考慮后，選擇功率600W[11]。

圖5 不同超聲功率對檳榔原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

2.2.5 超聲時間的確定

精確稱取1.0g檳榔干粉末5份、80%丙酮作為提取劑、料液比1:40(g/mL)，在相同超聲功率下考察不同的超聲時間對原花青素提取率的影響。

圖6 不同超聲時間對檳榔原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

如圖6所示，隨著超聲時間的延長，原花青素的溶出量增加。超聲時間15min時，原花青素提取率最高，但15min后，超聲時間的延長反而使原花青素提取率下降，這是因為超聲時間的延長增加了超聲波的作用強度，破壞了原花青素母核的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致原花青素提取率下降，故選擇超聲時間為15min[12]。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

表1 超聲波提取檳榔原花青素響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Coded values of corresponding actual values of independent variables in response surface design

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理[13]，綜合單因素影響試驗結(jié)果，選取丙酮體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間、超聲功率對原花青素提取影響顯著的4個因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平見表1。

2.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 超聲波提取檳榔原花青素響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

選用中心復(fù)合模型，做四因素三水平共29個試驗點(5個中心點)的響應(yīng)面分析試驗。這29個試驗點分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點，共有24個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估計試驗誤差。檳榔原花青素提取率為響應(yīng)值(指標(biāo)值)。

采用Design Expert 7.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程[14]，對超聲波輔助提取檳榔原花青素的影響因素進行更深入的研究和條件優(yōu)化，并做出響應(yīng)面圖。多元回歸擬合分析得到檳榔原花青素提取率與各因素變量的二次方程模型為：Y=2.8756＋0.4532X1＋0.183X2＋0.1734X3-0.0764X4＋0.2342X1X2＋0.634X1X3-0.27X1X4-0.423X2X3＋0.112X2X4-0.4453X3X4-0.182X2X4-0.493X22。

2.3.3 回歸方程方差分析

從表3可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，此時Quadratic回歸方差模型極顯著。從回歸方程各項的方差分析結(jié)果還可以看出方程的失擬項較小，表明該方程對試驗擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測[15]。從表3還可以看出，對提取率影響的大小依次為超聲功率(X2)、超聲時間(X1)、料液比(X3)、丙酮體積分?jǐn)?shù)(X4)。

表 3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.3.4 響應(yīng)面曲面分析

RSM方法的圖形是特定的響應(yīng)面(Y)與對應(yīng)的因素X1、X2、X3、X4構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，每個響應(yīng)面對其中兩個因素進行分析，另外兩個因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，從試驗所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用[16]?；貧w優(yōu)化響應(yīng)面圖分別見圖7。

圖7 各因素交互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.7 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

圖7 直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響，比較圖7中6個圖可知：超聲波功率(X2)對檳榔原花青素提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線相對較陡；其次為超聲時間(X1)，而料液比(X3)、丙酮體積分?jǐn)?shù)(X4)表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

根據(jù)所得到的模型，可預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最優(yōu)工藝條件為在室溫條件下，超聲功率596W、超聲時間15.42min、料液比1:39.67(g/mL)、丙酮體積分?jǐn)?shù)80.86%，此條件下，原花青素提取率理論可達3.42%。

2.3.5 驗證實驗

為了檢驗實驗結(jié)果是否與真實情況相一致，根據(jù)上述結(jié)果進行近似驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為室溫條件下，超聲功率600W、超聲時間16min、料液比1:40(g/mL)、丙酮體積分?jǐn)?shù)81%，在此條件下進行3次平行實驗，原花青素平均提取率3.41%。與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.01%。而且重復(fù)性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助提取技術(shù)對檳榔原花青素進行提取，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析對超聲波提取工藝進行優(yōu)化，得出較優(yōu)工藝條件為室溫條件下，超聲功率600W、超聲時間16min、料液比1:40(g/mL)、丙酮體積分?jǐn)?shù)81%，在此工藝條件下，檳榔原花青素提取率為3.41%，并得到檳榔原花青素總提取率與超聲波處理各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好。

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Process Optimization for Ultrasonic-assisted Solvent Extraction of Proanthocyanidins from Areca catechu L. Fruit by Response Surface Analysis

CHEN Jian，SUN Ai-dong*，GAO Xue-juan，PAN Na
(College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

The purpose of the current study was the optimization of the process for the solvent extraction of proanthocyanidins from Areca catechu L. fruit with ultrasonic assistance. First of all, the selection of extraction solvent was investigated. Secondly, one-factor-at-a-time (OFAT) experiments were done to figure out the effects of five process parameters for the extraction of proanthocyanidins with acetone aqueous solution, including acetone concentration in aqueous solution, extraction temperature, material-to-liquid ratio, ultrasonic power and ultrasonic treatment time on the extraction rate of proanthocyanidins. Thirdly, the relationship of the extraction rate of proanthocyanidins with the other four extraction conditions except extraction temperature was mathematically modeled on the basis of a four-variable, three-level central composite design (CCD) with 26 runs. Finally, the model established was subjected to analysis of variance to test the significance of various variables and response surface analysis to understand their pairwise interactive effects on the function. From the above investigations and analysis, we determined the optimum conditions for the extraction of proanthocyanidins from Areca catechu L. fruit to be: ultrasonic power of 600 W, ultrasonic treatment time of 16 min, the ratio of material to solvent of 1:40 (g/mL) and acetone concentration of 81%. Under these conditions, the maximum extraction rate of proanthocyanidins was up to 3.41%.

Areca catechu L.；proanthocyanidins；extraction；response surface methodogy

Q946.49

A

1002-6630(2011)04-0082-05

2010-05-06

陳健(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物生理活性物質(zhì)的開發(fā)與利用。

E-mail：chenjian19850702@163.com

*通信作者：孫愛東(1968—)，女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物生理活性物質(zhì)的開發(fā)與利用。

E-mail：adsun68@163.com