LC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法測定乳制品中的三聚氰酸

邢麗紅，孫偉紅，苗鈞魁，譚志軍，冷凱良*

LC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法測定乳制品中的三聚氰酸

邢麗紅，孫偉紅，苗鈞魁，譚志軍，冷凱良*

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

建立快速測定乳制品中三聚氰酸殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。用乙腈和水提取樣品中的三聚氰酸，乙腈二次去蛋白，10000r/min離心后，以電噴霧離子源負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，內(nèi)標(biāo)法定量。三聚氰酸在0.005～0.2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999。在空白樣品中添加三聚氰酸的平均回收率在91.7%～99.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%。液態(tài)奶類樣品和奶粉的定量限均為0.2mg/kg。

乳制品；三聚氰酸；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

三聚氰酸(cyanuric acid，CYA)，屬于三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，學(xué)名1,3,5-三嗪-2,4,6-(1H,3H,5H)三酮、S-三嗪-2,4,6-三醇、2,4,6-三羥基-1,3,5-三嗪，分子式C3H3N3O3，相對(duì)分子質(zhì)量129.07，簡稱氰尿酸、異氰脲酸。工業(yè)上用于有機(jī)合成氰尿酸-甲醛樹脂、涂料、黏合劑、農(nóng)藥除草劑、金屬氰化緩蝕劑、高分子材料改性劑和用于藥物鹵三羥嗪的生產(chǎn)，此外可作為游泳池的氯穩(wěn)定劑[1]。

對(duì)三聚氰酸的毒理學(xué)研究表明，三聚氰酸的急性毒性作用很低，體內(nèi)為惰性代謝，大部分以原型從尿液中排出，三聚氰酸大鼠經(jīng)口LD50為7700mg/kg，家兔經(jīng)皮LD50為1000mg/kg，屬于低毒和實(shí)際無毒級(jí)物質(zhì)[2-3]。大劑量作用時(shí)，主要對(duì)腎臟產(chǎn)生毒性，同時(shí)還可對(duì)心臟等腎臟以外的器官產(chǎn)生毒性作用，且對(duì)雄性動(dòng)物的毒性大于雌性動(dòng)物[4-7]。三聚氰酸還可由三聚氰胺水解生成，當(dāng)三聚氰酸和三聚氰胺在酸性條件下同時(shí)存在時(shí)，容易形成結(jié)晶，導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生。

目前，三聚氰酸主要的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[8-11]、高效液相色譜法[1,12-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-15]等。高效液相色譜法采用紫外檢測器檢測，靈敏度較差，且無法確證，不能滿足殘留檢測的要求，一般作為篩選方法。GC-MS法雖可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行確證，但需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，操作比較繁瑣，且靈敏度較差。LC-MS/MS法不需衍生，前處理操作簡單，是理想的確證方法。本實(shí)驗(yàn)旨在建立LC-MS/MS內(nèi)標(biāo)法快速測定乳制品中三聚氰酸的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售鮮牛奶、酸奶、奶粉，購于青島。

三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%) Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；氘代三聚氰酸內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL) 美國Cambrige Isotope Laboratories公司；乙腈(色譜純) 美國Merck公司；水為超純水；Oasis MAX固相萃取柱(60mg，3mL) 美國Waters公司；HR-XA固相萃取柱(60mg，3mL) Chromabond公司； PAX固相萃取柱(60mg，3mL) 艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Access 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；CR 22G冷凍離心機(jī) 日本日立公司；小型高速離心機(jī) 美國Sigma公司；KQ-600DE超聲波清洗器 江蘇昆山超聲波儀器有限公司；渦旋混合器 美國Talboys公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

液態(tài)奶類樣品：稱取約1g樣品，加入適量氘代三聚氰酸內(nèi)標(biāo)，再加入8mL乙腈，用水定容至10mL，充分渦旋混合1min，超聲20min，10000r/min離心10min，取上清液500μL于2mL塑料離心管，再加入500μL乙腈，充分渦旋混合1min，14000r/min離心10min，過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜，供LC-MS/MS測定。

奶粉：稱取約1g樣品，加入適量內(nèi)標(biāo)，再加入8mL乙腈和2mL水，充分渦旋混合1min，超聲20min，10000r/min離心10min，取上清液500μL于2mL塑料離心管，再加入500μL乙腈，充分渦旋混合1min，14000r/min離心10min，過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：PC HILIC(2.0mm×150mm，5μm)；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈-水=(90:10，V/V)，等度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子化模式：大氣壓噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；噴霧電壓：3500V；鞘氣壓力；30L/min，輔助氣流量：15L/min；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300℃；源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓：10V；碰撞壓力：氬氣，1.5mTorr；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表1。

表1 SRM模式下三聚氰酸質(zhì)譜測定的特征離子Table 1 Characteristic ions for MS determination of cyanuric acid

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01g，用乙腈溶解并定容至10mL，配成1mg/mL母液。將0.1mg/mL氘代三聚氰酸內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋0.01mg/mL中間液。將1mg/mL母液三聚氰酸和氘代三聚氰酸內(nèi)標(biāo)溶液用乙腈稀釋成三聚氰酸的質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2μg/mL，氘代三聚氰酸內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行LC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵流動(dòng)注射三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在m/z 100～150掃描范圍內(nèi)以ESI負(fù)離子模式進(jìn)行母離子全掃描，確定三聚氰酸的分子離子[M-H]-為m/z 128。然后，以m/z 128為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，主要產(chǎn)生m/z 42.5、84.7等子離子。其中m/z 84.7為三聚氰酸開環(huán)分子重排失去CNO的碎片離子峰([M-HCNO]-)，m/z 42.5為碎片離子峰([CNO]-)。選取豐度最強(qiáng)的子離子m/z 84.7和m/z 42.5作為三聚氰酸的監(jiān)測離子，最后以選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)負(fù)離子模式優(yōu)化錐孔電壓(skimmer offset)、碰撞能量(collision energy)等質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。三聚氰酸以子離子m/z 84.7和m/z 41.5及二者的相對(duì)豐度比來定性，以子離子m/z 84.7為定量離子，以色譜峰面積按內(nèi)標(biāo)法定量。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

三聚氰酸含有三個(gè)有機(jī)氮基團(tuán)，屬于強(qiáng)極性化合物，色譜柱的選擇至關(guān)重要。分別研究Agilent Inertsil ODS-3、Zorbax SB-C18、Eclipse XDB-C18和PC HILIC色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三聚氰酸在普通C18反相色譜柱上峰形較寬，保留較差，強(qiáng)度較低，見圖1。

圖1 三聚氰酸在C18色譜柱上的色譜圖Fig.1 Chromatogram of cyanuric acid in C18Column

根據(jù)化合物的性質(zhì)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇了既具有離子交換、又具有反相分離特點(diǎn)的PC HILIC色譜柱進(jìn)行分離，三聚氰酸能夠在此色譜柱上較好的保留，峰形比較尖銳，強(qiáng)度較高，并具有良好的重現(xiàn)性和適宜的保留時(shí)間，見圖2。

圖2 三聚氰酸在PC HILIC色譜柱上的色譜圖Fig.2 Chromatogram of cyanuric acid on PC HILIC column

對(duì)于流動(dòng)相中的有機(jī)相，一般采用甲醇和乙腈，由于采用電噴霧模式，而電離機(jī)理中一個(gè)重要的過程為去溶劑化，在負(fù)離子模式下，乙腈比甲醇更容易促進(jìn)離子化，故選擇乙腈為流動(dòng)相中的有機(jī)相。流動(dòng)相中的水相，應(yīng)盡量避免加入緩沖鹽，本實(shí)驗(yàn)采用超純水作為水相。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本方法采用乙腈和水按照9:1的比例等度洗脫，就可使三聚氰酸及其內(nèi)標(biāo)氘代物在色譜柱上達(dá)到很好的分離效果，流動(dòng)相的配制簡單快捷。

2.3 提取與凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

三聚氰酸微溶于水，能溶于熱水、熱乙醇、吡啶、濃鹽酸及硫酸，也溶于氫氧化鈉和氫氧化鉀水溶液，不溶于冷乙醇、醚、丙酮、苯和氯仿[2,7]。因此提取溶劑一般都選用極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑、緩沖溶液或水和有機(jī)溶劑的混合溶液。常見的提取溶劑有二乙胺-乙腈-水溶液、乙腈溶液和甲酸溶液、酸化甲醇、高氯酸等。

乙腈具有沉淀蛋白和去除部分脂肪的功能。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈和水作為提取劑，以有機(jī)相乙腈和水相的體積比例分別為4:6、5:5、6:4、7:3：8:2、9:1進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈和水的比例低于5:5時(shí)，離心之后的上清液仍然很渾濁，當(dāng)乙腈的比例逐漸升高時(shí)，上清液逐漸變得澄清透明。這是由于乳制品中蛋白質(zhì)含量較高，降低乙腈比例時(shí)，沉淀蛋白的效果較差，只有提高乙腈的比例才能將乳制品中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)沉淀。但當(dāng)乙腈與水相的比例達(dá)到9:1時(shí)，又會(huì)降低提取效率。本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈與水相的比例為8:2為最優(yōu)提取條件，即液態(tài)奶的提取劑乙腈與水的比例約為8:1，奶粉提取劑乙腈:水=8:2。

2.3.2 離心轉(zhuǎn)速的影響

由于蛋白是干擾色譜柱分離、影響峰形、造成峰拖尾極其重要的一個(gè)因素，因此離心在本實(shí)驗(yàn)中是一個(gè)關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)速越高，離心時(shí)間越長，沉淀蛋白、脂肪及其他雜質(zhì)的效果越好。對(duì)于乳制品類蛋白質(zhì)含量較高的樣品，當(dāng)高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速不低于8000r/min時(shí)，才能達(dá)到較好的分離效果。本實(shí)驗(yàn)選用10000r/min離心10min，即可保證去除絕大多數(shù)干擾物的影響。

在上清液中進(jìn)一步加入等體積的乙腈，其目的是進(jìn)一步去除提取液中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾。為了使提取液中微量的蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)能夠沉淀析出，在提高乙腈比例的同時(shí)，提高轉(zhuǎn)速至14000r/min，在二者的雙重作用下，提取液中的干擾物基本可以去除干凈。二次去除蛋白前后色譜對(duì)照?qǐng)D見圖3、4。

圖3 二次除蛋白前的色譜圖Fig.3 Chromatogram of cyanuric acid before protein removal

圖4 二次除蛋白后的色譜圖Fig.4 Chromatogram of cyanuric acid after protein removal

2.3.3 凈化方式

根據(jù)三聚氰酸的化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，應(yīng)選擇混合陽離子相萃取柱凈化。將三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過Waters Oasis MAX、Chromabond HRXA、Agele PAX固相萃取柱，比較3款固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3款固相萃取柱的回收率均較好，在90%以上。但實(shí)際樣品測定過程中，操作較為繁瑣，且成本較高。而本實(shí)驗(yàn)采用乙腈沉淀和高速離心二次去除蛋白的方法處理樣品，既節(jié)約成本，又簡化了前處理方法。

2.4 線性范圍和檢測限

按照1.3.2、1.3.3節(jié)方法配制標(biāo)準(zhǔn)系列并進(jìn)行測定，以色譜峰面積按內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果表明，三聚氰酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.005～0.2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=9.12×10-3X-6.55×10-3，相關(guān)系數(shù)大于0.999。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在陰性樣品中添加水平為0.2mg/kg時(shí)，三聚氰酸的信噪比(RSN)均大于10，而且方法學(xué)數(shù)據(jù)是可靠的，表明方法的定量限可以達(dá)到0.2mg/kg。

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

選擇陰性鮮牛奶、酸奶和奶粉樣品，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為0.2、0.5、1.0、2.0mg/kg，按上述方法處理，每個(gè)添加質(zhì)量濃度重復(fù)測定5次，做3個(gè)批次，考察方法的精密度，結(jié)果見表2。在空白樣品中添加三聚氰酸的平均回收率在91.7%～99.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%。

表2 乳制品中三聚氰酸的添加回收率Table 2 Recovery rates of cyanuric acid in dairy products spiked with standard material

2.6 樣品測定

通過對(duì)市售20份鮮奶、酸奶及奶粉樣品進(jìn)行測定，均未檢出三聚氰酸。

3 結(jié) 論

通過乙腈和水提取樣品中的三聚氰酸，乙腈二次去蛋白，以及優(yōu)化高效液相色譜及質(zhì)譜條件，建立了一種快速測定乳制品中三聚氰酸的方法，前處理簡單，無需固相萃取柱凈化，降低了成本，精確度高，重現(xiàn)性好，是一種理想的測定方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)市售20份乳制品進(jìn)行測定，均未檢出三聚氰酸。

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Determination of Cyanuric Acid in Dairy Products by HPLC-MS/MS

XING Li-hong，SUN Wei-hong，MIAO Jun-kui，TAN Zhi-jun， LENG Kai-liang*
(Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

A sensitive HPLC-MS/MS method with high selectivity was developed for the determination of cyanuric acid residues in dairy products. Cyanuric acid in samples was extracted into acetonitrile/water system. The extract was deproteinized by adding additional acetonitrile, followed by high-speed centrifugation, before HPLC-MS/MS analysis in the internal standard mode. Electrospray ionization was applied and operated in the negative ion mode. An excellent linear range of this method for the determination of cyanuric acid was 0.005-0.2μg/mL with a correlation coefficient of more than 0.999. The average recovery rates in dairy products spiked with standard material at concentration levels of 0.2, 0.5, 1.0 mg/kg and 2.0 mg/kg were in the range of 91.7% to 99.6% with relative standard deviations less than 10%. The limit of detection of this method was 0.2 mg/kg.

dairy products；cyanuric acid；high performance liquid chromotographay tandem mass spectrometry

TS207.3

A

1002-6630(2011)04-0143-05