絲裂原活化蛋白激酶在染料木黃酮抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用

余小平，程道梅，彭曉莉，賈皓，韓彬，2

（1.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 610083；2.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563003）

血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的活化、腫瘤細(xì)胞及ECs中促血管生成因子分泌的增加均可促進(jìn)腫瘤的血管生成［1－3］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是促腫瘤血管生成中最強(qiáng)的生長因子，通常由好氧細(xì)胞產(chǎn)生。VEGF與ECs表面的VEGF受體結(jié)合，不僅可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提高原ECs的活性［4］，還增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的分泌［5］。1987年，Akiyama等［6］首次證實染料木黃酮（genistein，Gen）是一種強(qiáng)效的蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）抑制劑。前期的研究證實，Gen可通過抑制HER－2／neu受體磷酸化和PTK活性而下調(diào)促血管生成因子的表達(dá)［7］，ECs參與了實體腫瘤的血管生成［8］。本研究旨在探討MAPK信號通路在Gen抑制ECs活性中的作用，揭示Gen抗血管生成的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Gen標(biāo)準(zhǔn)品和VEGF購自美國Sigma－Aldrich公司。［γ－32P］ATP購自北京Yahui生物醫(yī)學(xué)工程公司。氨基端激酶（JNK）抑制劑（SP600125）、p38抑制劑（SB203580）和 ERK1／2抑制劑（PD98059）購自美國Promega公司。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（MMP）－2／－9、TIMP－2／－9 酶 鏈 免 疫 吸 附 測 定（ELISA）試劑盒、Caspase－3活性分析試劑盒購自武漢Boster生物科學(xué)有限公司。抗phospho－JNK、抗phospho－p38、抗 phospho－ERK1／2、抗 phospho－MMP－2、抗phospho－MMP－9、通用型二抗以及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（ECL）購自北京Santa Cruz生物技術(shù)公司。Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶分析試劑盒購自日本Yagai公司。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)和處理

采用胰酶消化法分離健康非異常妊娠母親經(jīng)陰道所產(chǎn)健康胎兒的新鮮臍帶HUVECs，然后在含有20%特級胎牛血清、100U／ml盤尼西林、100μg／ml鏈霉素和75μg／ml內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（ECGS）的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。經(jīng)形態(tài)學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)法（F－3520抗體）鑒定后將第3～6代HUVECs接種于24孔培養(yǎng)板，分別用5 μg／ml VEGF或1、10、100μmol／L Gen處理24h。對照組用等量的二甲基亞楓（DMSO）替代VEGF和（或）Gen處理，DMSO的終濃度≤0.1%（v／v）。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）酶譜檢測和反相酶譜檢測

酶譜檢測中，將HUVECs培養(yǎng)液的上清冷凍液濃縮后在10%SDS－PAGE（含有1mg／ml凝膠）電泳。反相酶譜檢測中，將濃縮上清液在12%SDS－PAGE（0.5mg／ml凝膠＋10%的幼倉鼠腎細(xì)胞）4℃電泳，然后將凝膠用2.5%TritonX－100沖洗2次，每次15min以除去SDS。沖洗后的凝膠在酶譜緩沖液（50mmol／L Tris，pH 7.4，10mmol／L CaCl2，0.05%Brij 35）中37℃孵育過夜，考馬斯亮藍(lán)染色，最后用圖像分析軟件（Bio－Rad）對酶譜進(jìn)行定量分析。

1.4 蛋白免疫印跡檢測

條件培養(yǎng)基離心超濾、冷凍濃縮10倍，然后進(jìn)行SDS－PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。為阻斷非特異性結(jié)合，5% 脫 脂 奶 粉／Tris－緩 沖 液／0.2% 吐 溫 20 稀 釋MMP－2／－9抗體（1∶200）、MAPK抗體（抗－JNK／p38和抗－phospho－JNK／p38（1∶200）。采用 ECL 檢測蛋白表達(dá)情況。

1.5 MMPs表達(dá)分析

收集培養(yǎng)液上清，使用ELISA試劑盒按照說明書分析 MMPs（MMP－2／－9）及其抑制劑（TIMP－2／－9）的表達(dá)情況，450nm下測吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值，每個樣品測3次。

1.6 溶膠原和明膠分解活性分析

取新鮮分離的培養(yǎng)液上清，按II型和IV型膠原蛋白酶分析試劑盒操作指南進(jìn)行，檢測熒光標(biāo)記底物的清除情況，分析溶膠原和明膠分解活性。

1.7 統(tǒng)計分析方法

2 結(jié)果

2.1 Gen阻斷VEGF誘導(dǎo)HUVECs的MMPs分泌和活性

與對照相比較，VEGF處理后MMP－2和MMP－9水平顯著提高。Gen以劑量依賴方式（1～100μmol／L）降低 MMP－2（圖1A）和 MMP－9（圖1B）水平。電泳分析結(jié)果顯示，VEGF處理24h顯著增加MMP－2和MMP－9溶膠原活性，而Gen以劑量依賴性方式降低MMP－2和MMP－9溶膠原活性（圖1C）。結(jié)果提示，Gen處理HUVECs將減少VEGF誘導(dǎo)的MMP－2／－9的分泌，并降低其酶解活性。

為進(jìn)一步確定實驗中觀察到的Gen對HUVECs的抑制作用不是由于Gen直接與培養(yǎng)基中的蛋白酶相互作用引起的，將1、10或100μmol／Gen孵育HUVECs 24h后除去培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)在5μg／L VEGF中孵育4h。二次孵育終點時收集培養(yǎng)基，并用熒光標(biāo)記底物進(jìn)行分析。結(jié)果 發(fā) 現(xiàn)，Gen 對 MMP－2（圖 1E）and MMP－9（圖1F）活性仍表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，因而溶膠原和凝膠分解活性的下降是由于HUVECs釋放的MMP－2／－9蛋白數(shù)量的減少（圖1G）。

此外，還發(fā)現(xiàn)VEGF對TIMP－2／－9的分泌和活性均沒有影響，且Gen對TIMP－2／－9的含量及活性均也沒有顯著的影響（數(shù)據(jù)未顯示），由此認(rèn)為Gen對MMPs活性的抑制作用不是由于增加MMPs抑制劑TIMPs活性而導(dǎo)致的。

2.2 Gen抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中JNK和p38活化

已有研究顯示，VEGF介導(dǎo)的信號可通過MAPK磷酸化引起增殖反應(yīng)［9，10］。為確證 MAPK是否參與了VEGF誘導(dǎo)的增殖過程，分別利用JNK抑制劑 SP600125、p38抑制劑SB203580、ERK1／2抑制劑PD98059證實MAPK信號分子在VEGF信號通路中的可能作用。細(xì)胞凋亡率（圖2A）及凋亡蛋白酶capase－3活性（圖2B）結(jié)果顯示，SP600125（10μmol／L）和SB203580（10μmol／L）特異性地阻斷了VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化。VEGF誘導(dǎo)的MMP－2／－9的分泌也減少（圖2D）。而PD98059（10 μmol／L）不能降低 VEGF誘導(dǎo)的 MMP－2／－9的分泌，同時對細(xì)胞凋亡和死亡也沒有明顯影響。上述結(jié)果提示p38和JNK活化可能參與VEGF誘導(dǎo)MMPs生成。

用抗磷酸化JNK（圖3A）和抗磷酸化p38（圖3B）抗體檢測發(fā)現(xiàn)，HUVECs經(jīng)Gen處理后，劑量依賴性地減弱了VEGF介導(dǎo)的JNK和p38活化，Gen對VEGF誘導(dǎo)的ERK1／2活化作用沒有明顯影響，提示Gen可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的JNK和p38的活化。

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，Gen是一種強(qiáng)效的PTK活性抑制劑，可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)促血管生成因子VEGF、MMPs、uPA 的表達(dá)［7］。本研究結(jié)果顯示，作為強(qiáng)效的PTK抑制劑Gen，可通過抑制JNK和p38活化及MMPs的分泌和活性從而抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化，這可能是Gen抗血管生成作用的機(jī)制之一。Gen（4，5，7三羥異黃酮）為大豆產(chǎn)品中主要的異黃酮，在動物模型中能夠抑制癌癥發(fā)生［11，12］。體內(nèi)和體外實驗研究也顯示，Gen具有抗輻射和抗藥性，可用于癌癥的輔助治療［13］。

目前有關(guān)VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞，尤其對HUVECs中的信號通路的影響少有報道。正常成人的ECs是高度分化、相對靜止的。ECs的活化和增殖是血管生成的起始階段。本研究結(jié)果顯示，VEGF刺激后不僅增加了MMP－2／－9的分泌，而且使其溶膠原和明膠分解活力增大。MMPs能降解血管生成中腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分，該類酶通常都是以原酶的形式出現(xiàn)，在發(fā)揮降解基質(zhì)時需要活化［14－16］。Gen處理減少內(nèi)皮細(xì)胞中 MMP－2／－9的分泌，并使其活性降低，提示Gen具有抗血管生成作用，這與課題組前期的研究結(jié)果一致［7］。但對TIMPs的分泌及活性不影響，表明Gen對MMPs活性的抑制作用不是通過TIMPs實現(xiàn)的。

我們發(fā)現(xiàn)Gen以劑量依賴性抑制VEGF誘導(dǎo)的JNK和p38的磷酸化。該結(jié)果與已往文獻(xiàn)報道一致，即Gen可有效抑制位于腫癌組織或其他組織中的內(nèi)皮細(xì)胞 MAPK活性［17，18］，但 Gen未能顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞ERK－1／2的磷酸化水平，這與Sawai等［19］報道Gen能抑制二萜醇酯類誘導(dǎo)的ERK－1／2磷酸化的研究結(jié)果不一致。這種差異或許是因于實驗條件的不同而導(dǎo)致的。

Gen在體內(nèi)無法達(dá)到實驗中使用的濃度100 μmol／L［6，13］。單獨攝入大豆膳食時，人血漿中 Gen的最大濃度可達(dá)1～4μmol／L［20］。本研究中，將HUVECs暴露于10μmol／L和更高濃度的Gen后導(dǎo)致MMP－2／9生成減少。在本實驗中使用的濃度范圍內(nèi)，Gen同時可作為非選擇性酪氨酸激酶抑制劑和內(nèi)皮生長因子受體激酶抑制劑［7，21］。高濃度Gen處理后使 MMP－2／9生成減少，可歸因于抑制PTK活性。盡管未對該假設(shè)進(jìn)行論證，事實上在Gen抑制酪氨酸激酶濃度范圍內(nèi)，Gen已被用于探討對MMPs生成的抑制作用研究［22］。同時更高濃度Gen（20～370μmol／L）已被用于研究其對腦內(nèi)皮細(xì)胞中環(huán)前列腺素生成的影響［23］。

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