黑米花青素對大鼠視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷感光細(xì)胞凋亡和Caspase－1表達的影響

陳瑋，賈皓，余小平＊，伍秀華，李帥，劉洪，廖紀(jì)如，凌文華

（1.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 610083；2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080）

視網(wǎng)膜光損傷包括機械損傷、熱損傷和光化學(xué)損傷，其中光化學(xué)損傷是造成視網(wǎng)膜病變最為重要的因素［1，2］。在視網(wǎng)膜色素變性（RP）中，感光細(xì)胞的死亡和丟失主要是由光氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所致［1，2］。多種抗氧化劑皆能在一定程度上減輕氧化應(yīng)激水平，抑制細(xì)胞凋亡，防護 RP［3－5］?；ㄇ嗨兀ˋnthocyanins，ACs）是一類天然的植物多酚類化合物，具有較強的抗氧化和抗凋亡能力［6］。黑米花青素（BRACs）來自黑米皮，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)［7，8］，BRACs膳食干預(yù)能明顯抑制光氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脂質(zhì)過氧化，有效維護視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整。Caspase－1在視神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。本研究擬進一步觀察BRACs防護RPD中的抗凋亡作用，并檢測凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase－1的表達水平，以探討B(tài)RACs防護RPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BRACs由中山大學(xué)凌文華教授提供；托吡胩胺滴眼液購自武漢五景藥業(yè)有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒及引物合成皆由大連寶生物工程有限公司提供；原位末端標(biāo)注（TUNEL）試劑盒、Caspase－1抗體和免疫組織化學(xué)檢測試劑購自武漢博士德生物有限公司；清潔級Spregue－Dawley大鼠由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供；CMC－I型輻照儀、ST－80型數(shù)字式照度計由本課題組與西南大學(xué)聯(lián)合研制。FV1000激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司；PCR儀和核酸蛋白凝膠成像儀購自美國Bio－Rad公司。

1.2 實驗分組及處理

60只Spregue－Dawley大鼠，鼠齡6周，平均體重（160±15）g，雌雄不限，飼以AIN－93基礎(chǔ)飼料正常光照適應(yīng)1周后，隨機分為對照組（n＝30）和BRACs組（n＝30），二者均飼以基礎(chǔ)飼料，12h明／12h暗循環(huán)光照，其中BRACs組按100mg／kg·bw劑量給予BRACs，每天灌胃1次，對照組則予等量生理鹽水灌胃1次。處理15d后，兩組動物同時給予（3000±200）lux強度的白色熒光持續(xù)光照24h，RP模型參照文獻［5］的方法建立。

1.3 組織取材與切片制作

大鼠光照后，乙醚麻醉，迅速摘取眼球，其中左眼球提取總RNA，右眼球則置于10%的福爾馬林液中固定24h，然后常規(guī)脫水，浸蠟、石蠟包埋，經(jīng)視神經(jīng)矢狀縱切，制成5μm厚切片，用于TUNEL和免疫組織化學(xué)檢測。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡檢測采用TUNEL法。取前述制備的視網(wǎng)膜石蠟切片，按試劑盒說明進行操作，激光共聚焦顯微鏡觀察并分析。凋亡結(jié)果以凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）表示（AI＝凋亡細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.5 視網(wǎng)膜總RNA提取及RT－PCR

按RNA提取試劑盒說明提取左眼球總RNA，核酸蛋白微量檢測儀測定其含量與純度，－80℃保存。

RT－PCR按試劑盒說明進行，內(nèi)參GAPDH上游引物：5＇－GTG CTG AGT ATG TCG TGG AGT CT－3＇，下 游 引 物：5＇－GTG GAA GAA TGG GAG TTG CTG T－3＇，擴 增 長 度 610 堿 基 對 （bp）；Caspase－1 上 游 引 物：5＇－GTG GAG AGA AAC AAG GAG TGG T－3＇，下 游 引 物：5＇－TCA GTG GTT GGC ATC TGT AGT C－3＇，擴增長度310bp。擴增條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)33次。

RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。半定量PCR特異條帶值以相對吸光度（intensity）×面積（mm2）表示，mRNA表達結(jié)果以各組的吸光度與內(nèi)參GAPDH吸光度的比值表示（V value）。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測Caspase－1蛋白表達

免疫組織化學(xué)染色法按博士德公司說明書操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，30ml／L H2O215min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，正常羊血清封閉組織非特異性抗原，15min，棄上清，滴加Caspase－1抗體［陰性對照用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗］，37℃、孵育1h；PBS蕩洗，滴加生物素化二抗，37℃、孵育30min；PBS蕩洗，滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃、30min，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，反藍，脫水透明封片，普通光學(xué)顯微鏡觀察，拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。ANOVA單因素方差分析檢驗同一組內(nèi)不同光照時相點差異，t檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRACs對視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷中感光細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測結(jié)果顯示，光照后視網(wǎng)膜感光細(xì)胞陽性率顯著增加（P＜0.01），而BRACs組感光細(xì)胞凋亡陽性率顯著低于對照組（P＜0.01）（圖1）。

2.2 BRACs對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞 Caspase－1mRNA表達的影響

RT－PCR檢測結(jié)果顯示，光照后視網(wǎng)膜感光細(xì)胞Caspase－1mRNA表達增加。而BRACs干預(yù)使其表達下調(diào)，并在0、3、24h處顯著低于對照組（P＜0.05）（圖2）。

2.3 BRACs對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞Caspase－1蛋白表達的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Caspase－1陽性染色呈棕黃色。未光照的大鼠視網(wǎng)膜未見明顯著色（圖3A）；光照24h對照組和BRACs組視網(wǎng)膜外核層和內(nèi)核層均出現(xiàn)陽性染色（圖3B）；而相對于對照組，BRACs組視網(wǎng)膜的陽性染色強度明顯低于對照組，即BRACs干預(yù)抑制光照后Caspase－1蛋白的表達（圖3B，3C）。

3 討論

氧化應(yīng)激和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷過程中起著關(guān)鍵作用［1，2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，BRACs干預(yù)能夠明顯減輕光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平，維護視網(wǎng)膜組織形態(tài)的完整［7，8］。本研究進一步探討了BRACs對RPD感光細(xì)胞凋亡和凋亡蛋白caspase－1表達的影響。

圖2 BRACs降低視網(wǎng)膜感光細(xì)胞caspase－1mRNA表達（n＝3）Fig.2 BRACs down－regulated the mRNA expression of caspase－1in photochemical damaged retinas（n＝3）

細(xì)胞凋亡在視網(wǎng)膜的發(fā)育和病變過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，急性光損傷中感光細(xì)胞丟失的主要方式是凋亡［1，2］。已有研究顯示，各種內(nèi)源和外源的抗氧化劑能降低光氧化應(yīng)激，抑制感光細(xì)胞凋亡［3－5］。本研究結(jié)果顯示，BRACs干預(yù)顯著降低凋亡感光細(xì)胞的數(shù)量，具有明顯的抗凋亡作用。結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)BRACs的抗氧化作用，進一步證實氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)的凋亡在視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷中的關(guān)鍵作用。

半胱氨酸蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。其級聯(lián)活化是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。Caspase－1是該家族中第一個被發(fā)現(xiàn)和命名的成員，主要負(fù)責(zé)白細(xì)胞介素（IL）－1β的成熟和轉(zhuǎn)運，參與炎癥反應(yīng)［9］。

Katai等［10］首先發(fā)現(xiàn)，Caspase－1在感光細(xì)胞凋亡中具有重要作用。Krishnamoorthy等［11］的體外實驗證實，抑制Caspase－1可以保護光誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡。Wu等［12］發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷中，高強度的持續(xù)光照可使小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞內(nèi)NF－κB活性降低，Caspase－l表達增加，從而促進感光細(xì)胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn)，膳食添加牛磺酸可下調(diào)Caspase－l表達，抑制光氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡［5］。本研究結(jié)果提示，BRACs灌胃干預(yù)能有效防護細(xì)胞凋亡，顯著抑制Caspase－l的mRNA和蛋白表達水平，進一步證實了Caspase－l在視網(wǎng)膜光損傷病變中的重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，BRACs可能通過下調(diào)Caspase－l表達，抑制感光細(xì)胞凋亡，有效降低光氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷，而有關(guān)BRACs通過何種途徑調(diào)節(jié)Caspase－1表達，則有待深入研究加以探討。

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