正交設(shè)計法優(yōu)選香白通絡(luò)巴布膏藥材的提取方法

張 欽 任世禾

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，200071）

正交設(shè)計法優(yōu)選香白通絡(luò)巴布膏藥材的提取方法

張 欽 任世禾

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，200071）

@香白通絡(luò)巴布膏藥；正交設(shè)計法

香白通絡(luò)巴布膏由白芥子、乳香、冰片等藥物組成，由本院腦病科根據(jù)多年臨床實踐組方而成，具有祛風(fēng)通絡(luò)、牽正口之功效，用于穴位敷貼治療面癱，療效顯著。白芥子為方中君藥，取其祛風(fēng)通絡(luò)、化痰散結(jié)之功效，文獻資料［1-2］表明白芥子、乳香的主要活性成分適宜于乙醇提取。本文擬采用正交設(shè)計法，以白芥子中主要成分芥子堿硫氰酸鹽的含量及提取物浸膏得率為考察指標(biāo)，優(yōu)選藥材的最佳乙醇回流提取工藝條件，為合理提取藥物的有效成分提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 HPLC series，Degasser G1322A，QuatPump G1311A，TCC G1316A，DAD G1315D色譜儀（美國安捷倫公司）；SK7210HP型超聲波洗滌機（上?？茘u超聲儀器有限公司）；HWS-11型電熱恒溫水浴鍋（上?；厶﹥x器有限公司）；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 白芥子（批號：LY09110023，產(chǎn)地：甘肅）、乳香（批號：100304，產(chǎn)地：埃塞俄比亞）藥材取自本院中藥房，符合《中國藥典》2010年版一部的有關(guān)規(guī)定。乙腈色譜純（上海強順化學(xué)試劑有限公司），磷酸二氫鉀分析純（天津永大化學(xué)試劑）。芥子堿硫氰酸鹽對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111702-200501），重蒸餾水（實驗室自制）。

2 方法及結(jié)果

2.1 芥子堿硫氰酸鹽含量測定

2.1.1 色譜條件 參照有關(guān)文獻［3］，以乙腈（流動相A）-0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液（流動相B）為流動相。實驗比較了流動相A∶流動相B=30∶70及20∶80兩種不同比例流動相系統(tǒng)對峰形的影響，結(jié)果顯示當(dāng)流動相A∶流動相B=30∶70時，出峰時間較早，峰形較好，圖譜見圖1、2。確定色譜條件：資生堂C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈∶0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液=30∶70；流速1.0mL/ min；柱溫為室溫；進樣量20μL；檢測波長326nm。

2.1.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（五氧化二磷干燥器中減壓干燥48h）5.0mg，置25mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.2mg·mL-1的對照品溶液。供試品溶液的制備：取白芥子、乳香粗粉各10g，加6倍量50%乙醇浸漬30min，80℃回流2h，減壓濃縮至干浸膏。取浸膏適量，加流動相溶解，30℃超聲10min，定容至10mL，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

圖1 芥子堿硫氰酸鹽對照品HPLC色譜圖，流動相為乙腈∶0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液=30∶70

圖2 芥子堿硫氰酸鹽對照品HPLC色譜圖，流動相為乙腈∶0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液=20∶80

2.1.3 線形關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下的對照品溶液2、3、4、5、6mL，以流動相稀釋并定容至10mL，配制成濃度分別為0.04mg·mL-1、0.06mg· mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.12mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.45μm微孔濾膜。注入液相色譜儀分析。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進樣濃度（mg· mL-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 38041.3974+192.0128，r=0.9957，在0.04mg·mL-1～0.12mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液20μL，重復(fù)進樣6次，測定芥子堿硫氰酸的峰面積。結(jié)果峰面積平均值為4539.2，RSD=0.89%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.2”項下的供試品溶液20μL，分別于0、2、4、6、8h進樣，測定芥子堿硫氰酸鹽各時間點的峰面積。結(jié)果，峰面積平均值為3541.9，RSD=1.39%，表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。圖譜見圖3。

2.2 正交設(shè)計篩選藥材的提取工藝

2.2.1 因素與水平的設(shè)計 以白芥子中主要成分芥子堿硫氰酸鹽的含量及提取物浸膏得率為考察指標(biāo)，篩選白芥子、乳香2藥合并乙醇提取的最佳工藝條件。選取影響較大的3個因素乙醇濃度（A）、溶劑用量（B）、提取時間（C），按照正交設(shè)計表L9（34）進行考察，每個因素設(shè)計3個水平，提取次數(shù)為1次，因素水平安排見表1。

表1 因素水平表

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取白芥子、乳香藥材粗粉，按表2設(shè)定的因素水平，“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備。

2.2.3 芥子堿硫氰酸鹽含量的測定 吸取上述定容液，按“2.1.1”項色譜條件進樣分析，測得峰面積積分值，代入回歸方程，計算芥子堿硫酸鹽含量，結(jié)果見表2，方差分析見表3、4。由表2得出：影響香白通絡(luò)巴布膏藥材提取物得率的3個因素中，提取溶劑用量（因素B）的極差值最大，說明溶劑用量的影響最大，其次是提取時間（因素C）和乙醇濃度（因素A）。考慮到巴布劑對載藥量有限，提取物浸膏得率低有利于巴布劑成型，所以最佳提取條件是A1B1C1。影響芥子堿硫氰酸鹽提取量的3個因素中，乙醇濃度（因素A）的極差值最大，說明乙醇濃度的影響最大，其次是溶劑用量（因素B）和提取時間（因素C）。所以最佳提取條件是A2B2C3。由表3、4可知：乙醇濃度、溶劑用量、提取時間3個因素對提取物浸膏得率及芥子堿硫氰酸鹽提取量的影響均無顯著性差異。

表2 正交試驗方案與結(jié)果

表3 提取物浸膏得率方差分析結(jié)果

表4 芥子堿硫氰酸鹽測定數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果

2.2.4 驗證試驗 為了確定提取條件，并考察A1B1C1、A2B2C32種提取工藝的穩(wěn)定性，精密稱取白芥子、乳香藥材粗粉各10g，按上述2種工藝條件乙醇回流提取，平行試驗3份。按上述浸膏的制備及供試液的制備與測定方式進行測定、計算，結(jié)果見表5。驗證試驗結(jié)果表明，2種提取工藝條件均較為穩(wěn)定。A2B2C3條件下提取物中芥子堿硫氰酸鹽的含量較高，該工藝條件相較于A1B1C1條件下的提取物浸膏得率略高。由于君藥的主要成分芥子堿硫氰酸鹽是藥物療效發(fā)揮的主要影響因素，而提取物浸膏得率僅對巴布劑成型工藝產(chǎn)生影響，因此，為了提高藥物療效，選擇A2B2C3為最佳提取工藝條件，即乙醇濃度為60%，溶劑用量為8倍量，提取時間為1h。

表5 驗證試驗結(jié)果

3 討論

3.1 2010年版《中國藥典》一部“芥子”項下所列芥子堿硫氰酸鹽的HPLC含量測定方法已由“苯基色譜柱、乙腈-3%醋酸梯度洗脫流動相系統(tǒng)”改為“C18色譜柱、乙腈-0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液流動相系統(tǒng)”。本實驗對流動相中乙腈、磷酸二氫鉀的比例進行考察，確定流動相為乙腈∶0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液=30∶70，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗表明該分析方法快速、精確。

3.2 經(jīng)正交篩選得到最佳提取工藝為：將藥材粗粉加入藥材量8倍的60%乙醇，浸漬0.5h，熱回流1h。藥材應(yīng)提前粉碎成粗粉，藥材不經(jīng)粉碎不利于有效成分溶出，粉碎過細，提取液過于黏稠，過濾困難。優(yōu)化后的提取工藝溶劑用量適中，提取時間較短，可節(jié)約制劑生產(chǎn)成本。

3.3 正交試驗表明，提取時間雖然不是影響提取物得率的主要影響因素，但是隨著提取時間的延長，提取物得率出現(xiàn)先升后降的趨勢，推測可能是由于藥材中揮發(fā)性成分較多，隨提取時間延長而損失，所以提取時間不宜過長。本實驗僅對處方中君藥白芥子所含的芥子堿硫氰酸鹽進行檢測，建議對提取物中揮發(fā)性成分進行含量測定，進一步控制制劑質(zhì)量。

［1］李小莉，張迎慶，黃通華.白芥子提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2007，21（6）：28-30.

［2］鄭杭生，馮年平，陳佳，等.乳香沒藥的提取工藝及其提取物的鎮(zhèn)痛作用.中成藥，2004，26（11）：956-958.

［3］杜松云，李其蘭，余軍，等.RP-HPLC法測定白芥子中芥子堿硫氰酸鹽的含量.中國藥房，2007，18（27）：2126-2128.

（2011 -01 -05 收稿）