吸煙誘發(fā)的小鼠肺氣腫模型的建立

邢國宏，孔立新，景洪標

肺氣腫動物模型在肺氣腫發(fā)病機制研究中具有特別重要的意義，建立標準化符合臨床實際的肺氣腫動物模型也一直是國內外學者探索的課題。木瓜蛋白酶及豬胰彈性蛋白酶等酶類氣管內滴入是肺氣腫動物模型制作的主要方法，近年也有基因修飾造成的肺氣腫模型[1]。但這些動物模型與人類由長期吸煙慢性刺激引起的肺氣腫病理變化不完全一致。為更貼近臨床實際的肺氣腫研究，筆者建立了香煙煙霧刺激誘發(fā)的小鼠肺氣腫模型。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 鼠齡為12周的雄性C57BL6小鼠（中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供）36 只，體重（21.2±1.9） g。 隨機分為 3 組，每組 12只，分別是A組 （吸煙90 d組）、B組 （吸煙180 d組）和C組（對照組）。

1.2 染毒方法 將小鼠置于自制的有機玻璃染毒箱內，80 cm×60 cm×58 cm，箱頂留有直徑1.5 cm的通氣孔，箱內放置鈉石灰吸收二氧化碳，以無水氯化鈣吸收水蒸汽。金健牌紙煙（北京卷煙廠，焦油含量14 mg）點燃后置染毒箱內，5支/次，持續(xù)30 min/次，2次/d，兩次吸煙間隔4 h，吸煙之外的時間正常飼養(yǎng)。A組小鼠連續(xù)吸煙90 d，B組連續(xù)吸煙180 d。C組不吸煙常規(guī)飼養(yǎng)180 d。吸煙組小鼠于吸煙完成后當日，對照組小鼠于飼養(yǎng)第180天摘眼球放血處死。開胸游離心肺，氣管插管并固定氣管插管后，完整取出心肺組織。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）制備和細胞計數分類 經氣管插管行雙肺支氣管肺泡灌洗（BAL）。用生理鹽水0.8 ml/次分次經氣管插管緩慢灌洗，連續(xù)5次，回收率均>70%。將所得BALF離心（1 500 r/min離心10 min），留取上清液他用，離心細胞沉淀用Hank’s液沖洗、離心3次，最后調整溶液為1 ml，在白細胞計數板上光鏡下計數BALF中的炎癥細胞總數，并制成細胞涂片，瑞氏染色后做分類計數。

1.4 肺組織病理組織學標本制備及肺氣腫評價灌洗后，經氣管插管25 cmH2O（1 cmH2O=0.98 kPa）壓力下，以10%中性甲醛雙肺灌注固定60 min，之后置肺臟于10%甲醛溶液固定24 h以上，石蠟包埋。矢狀面5μm連續(xù)片制備防脫切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察。每個標本做2張切片，每張切片隨機選取上、中、下、左和右5個視野，用HIPS-1000多功能彩色病理圖文分析系統(tǒng)（同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司），100倍放大對每視野的肺泡數量和平均肺泡表面積進行計數測定。

1.5 統(tǒng)計學分析 資料建數據庫，用SPSS12.0軟件進行數據統(tǒng)計處理。所測數據先求出組內±s，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 大體情況 A、B組小鼠豎毛，毛發(fā)無光澤。吸煙180 d鼠毛發(fā)稀疏，體弱瘦小。吸煙90 d后，A、B組小鼠體重偏低，但無統(tǒng)計學差異。吸煙180 d后，B組小鼠體重顯著降低。體重比較見表1。

表1 各組小鼠吸煙前后體重（g，±s）

表1 各組小鼠吸煙前后體重（g，±s）

與C組比較，*P<0.05

組別 n 體重吸煙前 吸煙90 d 吸煙180 d A 組 12 21.4±1.6 24.4±2.4 0 B 組 12 21.1±1.5 24.3±2.3 27.4±2.6*C 組 12 21.0±1.6 25.9±2.5 30.2±2.8

2.2 BALF炎癥細胞計數及分類 A、B兩組小鼠BALF中炎癥細胞數增加，巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量均顯著增加，尤以B組。詳見表2。而巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞各自所占比例變化不明顯。

表2 各組小鼠BALF炎癥細胞計數和分類計數（×108/L，±s）

表2 各組小鼠BALF炎癥細胞計數和分類計數（×108/L，±s）

與 C組比較，*P<0.01；與A組比較，＃P<0.05

組別 n 白細胞總數 巨噬細胞 淋巴細胞 中性粒細胞A 組 12 14.76±1.22* 13.04±1.19* 1.49±0.16* 0.24±0.03*B 組 12 18.29±2.05＃ 15.81±1.64＃ 2.10±0.19＃ 0.37±0.05＃C 組 12 3.06±0.42 2.73±0.33 0.30±0.04 0.03±0.01

2.3 肺組織病理學改變 B組小鼠肺組織病理切片HE染色，肺內細支氣管、終末細支氣管表現出不同程度的慢性炎性細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤及分泌物阻塞；肺內呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴大，肺泡間隔、肺泡壁多處斷裂，局部炎癥細胞浸潤，部分肺泡互相融合形成肺大泡。A組小鼠肺組織可見炎癥改變，肺泡壁破壞不明顯。C組肺組織學無異常。各組小鼠平均肺泡面積分別是，A 組（5 859.99±252.78） μm2，B 組（14 776.71±637.57）μm2，C 組 （4 825.05±238.47）μm2。 B 組和 C組比較，有非常顯著性差異（P<0.01）；B組和A組之間也有非常顯著性差異（P<0.01）；A組和C組之間差異不顯著。

3 討 論

肺氣腫是危害人類健康的常見疾病，雖然對其發(fā)病機理有很多的研究，但其發(fā)病機制仍未完全闡明。肺氣腫是一種慢性進展性疾病，所以對人體進行直接研究有很大的局限，往往是窺豹之一斑。因而動物模型在該病相關的基礎及臨床研究中，較之其他疾病，作用更加突出。建立標準化符合臨床實際的肺氣腫動物模型，一直是國內外學者探索的課題。所謂符合臨床實際，很重要的一點就是動物疾病制模過程中的致病因素與臨床一致。現已公認，吸煙是肺氣腫的最主要致病因素。本研究模擬了臨床患者的慢性吸煙過程。實驗結果顯示，小鼠吸煙后BALF中炎癥細胞數量增加，肺組織出現炎癥改變，到吸煙180 d時肺內呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴大，肺泡間隔、肺泡壁多處斷裂，部分肺泡互相融合形成肺大泡，出現了明顯的肺氣腫改變。

吸煙是引起肺氣腫發(fā)病的最主要原因，但吸煙引起肺氣腫的機制仍不十分清楚。有研究表明，煙草煙霧有直接毒害作用，能使支氣管上皮纖毛變短、不規(guī)則，纖毛運動發(fā)生障礙，削弱肺泡吞噬細胞的吞噬、滅菌作用，導致黏膜纖毛系統(tǒng)結構和功能異常，引起支氣管痙攣，增加氣道阻力。煙草煙霧過度接觸，會造成細胞壞死。更重要的是，而壞死細胞釋放的細胞內酶及溶酶體內容物可以放大組織損傷，造成炎癥細胞聚集，致周圍組織損害[2]。煙霧中存在大量氧化劑和自由基，可引起呼吸系統(tǒng)組織細胞的氧化劑和抗氧化失平衡，直接損傷細胞功能，煙草煙霧中的氧化劑可以直接破壞肺組織細胞基質成分，煙草煙霧還可以干擾彈性蛋白的合成和修復[3]。吸煙刺激呼吸道上皮細胞釋放IL-8、細胞間粘附分子-1及轉化生長因子，向氣道募集白細胞，造成炎癥反應[4]。吸煙可以激活巨噬細胞釋放炎性介質，諸如腫瘤壞死因子-α、IL-8、單核細胞趨化肽－1和白三烯B4。巨噬細胞也產生蛋白水解酶，如基質金屬蛋白酶－2、－9和－12， 組織蛋白酶 K、L 及 S。Lim等研究證明慢性阻塞性肺疾病患者巨噬細胞合成釋放炎性介質的能力更強，并隨著反復的煙草煙霧暴露，這種活性會進一步加強[5]。近年研究認為細胞凋亡是肺氣腫發(fā)生機制之一，已有資料證實吸煙可誘發(fā)Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡[6]。

由于肺氣腫患病者數多、病死率高，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，因此深入肺氣腫發(fā)病機理研究具有重要的臨床和社會意義。全球8O%的肺氣腫患者與長期大量吸煙有關。吸煙誘發(fā)的小鼠肺氣腫模型能較好地模擬人類肺氣腫的發(fā)病過程，可能為肺氣腫基礎和臨床研究提供一種更確切實用的工具。

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