侯金才，張 鵬，劉建勛，韓 笑，李 丹，王秀輝

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗中心，北京 100091)

缺血缺氧是腦缺血重要的病理進程，預(yù)防和治療腦缺血時的炎癥反應(yīng)是治療腦缺血的關(guān)鍵。TLR4已被證明在腦缺血時引起局部組織炎性反應(yīng)的重要受體，它介導(dǎo)細(xì)胞的天然免疫過程［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織只中的免疫細(xì)胞，它的活化使局部組織產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)。因此，本實驗對原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞進行缺氧/復(fù)氧，模擬腦缺血時腦組織內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境，借以激活TLR4通路，然后用清熱解毒中藥梔子的有效提取物梔子苷(geniposide)進行干預(yù)，從TLR4信號通路探討梔子苷治療腦缺血的機制。

1 材料與方法

1.1動物和主要試劑新生SD大鼠(出生24 h內(nèi))，級別 SPF/VAF，動物合格證號:SCXK-(京)2006-0009，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

DMEM/F12培養(yǎng)基:Gibco公司;胰蛋白酶:Sig-ma公司;CD11b抗體:Chemicon公司，羊抗小鼠IGFITC與羊抗兔IG-TexRed均購于北京博奧森生物公司。TLR4、MyD88、pI-κB、NF-κBp65、p38 和 p-ERK1/2抗體均購于Abcam公司。梔子苷(純度95.2%，批號110715-200212，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)無菌條件下取出新生大鼠雙側(cè)大腦半球，置于預(yù)冷的解剖液中，迅速剝除腦膜，剔除髓質(zhì)的大部分，置于添加了5%胎牛血清的DMEM/F12中，剪碎成1 mm3的組織塊，1 000×g離心10 min，棄去上清，用0.25%胰酶+1 mmol·L－1EDTA的消化液于37℃中消化組織塊25 min，期間反復(fù)振搖兩次，以血清中止消化，之后反復(fù)吹打使之成為單細(xì)胞懸液，1 000×g離心10 min，棄去上清，D-hank's洗兩次，過200目的尼龍濾網(wǎng)，收集懸液1 000×g離心10 min，棄去上清，用添加了10%胎牛血清和青霉素1×105U·L－1、鏈霉素1×105U·L－1的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至4 個75 cm2培養(yǎng)瓶中，15 ml/瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3 d后換液去除死亡的細(xì)胞碎片，10 d左右混合膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿瓶底時，旋緊瓶蓋，石蠟?zāi)し饪?，?7℃的恒溫?fù)u床中以200 r·min－1的速度振搖約12 h，收集細(xì)胞懸液，置于新培養(yǎng)瓶(板)中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕振搖培養(yǎng)瓶5 min，棄上清，所剩為小膠質(zhì)細(xì)胞，換上新鮮含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。

1.3小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定將小膠質(zhì)細(xì)胞接種到覆蓋玻片的培養(yǎng)孔內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，取出細(xì)胞，PBS沖洗，4%聚甲醛固定，一抗用CD11b(1∶100)，二抗為羊抗兔IG-FITC(1∶100)，0.01%的DAPI復(fù)染細(xì)胞核，1∶9甘油緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察。

1.4缺氧/復(fù)氧模型的制備和實驗分組取生長狀態(tài)良好的小膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1，接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 ml，待細(xì)胞生長至80%匯合狀態(tài)后，用PBS清洗兩次，更換培養(yǎng)液無糖DMEM培養(yǎng)液。缺氧在厭氧培養(yǎng)盒進行，將培養(yǎng)板放入缺氧盒內(nèi)，向盒內(nèi)通入含95%N2和5%CO2的混合氣體，20 min(流量 1.5 L·min－1)，夾閉盒的出口與入口，37℃培養(yǎng)4 h，換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h即為缺氧/復(fù)氧模型。實驗分組:①對照組:用正常培養(yǎng)液培養(yǎng);② 模型組:缺氧4 h，復(fù)氧12 h;③梔子苷低劑量組、中劑量組、高劑量組分別在缺氧時加入用無糖DMEM配制的終濃度分別為 125 μmol·L－1(低劑量組)、250 μmol·L－1(中劑量組)和 500 μmol·L－1(高劑量組)梔子苷，在復(fù)氧時加入由正常培養(yǎng)液配制的相應(yīng)濃度的藥物。梔子苷藥物濃度的選定是根據(jù)前期MTT的實驗結(jié)果，在 125 μmol·L－1梔子苷對正常和缺氧/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞的活性沒有影響，250 和 500 μmol·L－1梔子苷能夠不同程度地促進正常和缺氧/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。

1.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4 mRNA的表達用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280為1.8～2.0，證實RNA純度符合RT-PCR反應(yīng)要求。以總RNA為模板，用Oligo-d(T)18為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，特異性引物分別擴增TLR4和β-actin。TLR4引物序列為上游5'-GCACTGTTCTTCTCCTGCC-3'，下游5'-GTTTCCTGTCAGTATCAAG-3'(250 bp)。β-actin引物序列:上游 5'-TGTGCTATGTTGCCCTAGACT-3'，下游 5'-TCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3'(442 bp)。PCR條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃ 延伸 30 s，TLR4 循環(huán) 35 次，β-actin循環(huán)30次，最后72℃延伸7 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。實驗重復(fù)3次，用Qautity One軟件分析TLR4與β-actin的PCR產(chǎn)物灰度值，以二者比值來表示TLR4 mRNA的相對表達量。

1.6Western blot檢測TLR4、p-IκBα、p38、p-ERK1/2蛋白將缺氧/復(fù)氧和LPS刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞以冰冷的PBS終止，洗兩次，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠和10%的分離膠)，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗體TLR4、p-IκB、p38、p-ERK1/2，陽性對照用 β-actin 單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液(1∶3 000)37℃孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值。實驗重復(fù)3次，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達量。

1.7MyD88和NF-κB免疫熒光雙染將小膠質(zhì)細(xì)胞接種到覆蓋玻片的培養(yǎng)孔內(nèi)，貼壁生長48 h后，進行缺氧/復(fù)氧和梔子苷干預(yù)后，取出細(xì)胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，一抗分別為MyD88(小鼠抗大鼠)和 NF-κBp65(兔抗大鼠)，抗體濃度為1∶200;二抗為羊抗小鼠 IG-TexRed和羊抗兔 IGFITC(1∶200)，0.01%的DAPI復(fù)染細(xì)胞核，1∶9甘油緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定培養(yǎng)3 d時首次換液倒置顯微鏡下觀察分離出的細(xì)胞呈團狀聚集，均勻鋪于瓶底;6 d后可見大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞團中爬出伸展，鋪于星形膠質(zhì)細(xì)胞之上的胞體較小而發(fā)亮、折光性強、突起短小彎曲而密集、形如蜘蛛腿的則是小膠質(zhì)細(xì)胞，另外有少數(shù)圓形或者橢圓形的小膠質(zhì)細(xì)胞呈一定程度活化狀態(tài);10 d后小膠質(zhì)細(xì)胞基本匯合，此時可以振搖純化小膠質(zhì)細(xì)胞。純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞牢牢地貼附于瓶底生長，大部分小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，折光性強而發(fā)亮，突起短小彎曲，形似蜘蛛腿，少數(shù)可見細(xì)長突起;還有一部分小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形、扁圓形、或棒狀，這樣的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示出一定程度的活化狀態(tài)。

Tab 1 Effect of geniposide on the hypoxia/reoxygenation induced microglia(±s，n=3)

Tab 1 Effect of geniposide on the hypoxia/reoxygenation induced microglia(±s，n=3)

*P＜0.01 vs model

Group Control Model Geniposide/μmol·L －1 125 μmol·L －1 250 μmol·L －1 500 μmol·L －1 TLR4 0.3019 ±0.012* 0.4527 ±0.028 0.4319 ±0.022 0.4401 ±0.035 0.2857 ±0.016*p-ERK1/2 0.2964 ±0.035* 0.5361 ±0.051 0.5085 ±0.043 0.2894 ±0.015* 0.3018 ±0.016*p-IκB 0.3545 ±0.041* 0.4908 ±0.042 0.3853 ±0.031 0.3038 ±0.037* 0.3116 ±0.024*p38 0.2737 ±0.016* 0.4426 ±0.039 0.4318 ±0.033 0.3179 ±0.028* 0.2824 ±0.019*

小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定用CD11b抗體，細(xì)胞膜上有明顯的綠色熒光染色，胞核空泡樣，符合細(xì)胞膜分布的特點，證實為小膠質(zhì)細(xì)胞。

2.2 TLR4mRNA的PCR結(jié)果TLR4mRNA的表達(Fig 1，2)和TLR4蛋白的表達(Tab 1)在趨勢上基本一致，對照組和高劑組與模型組比差異有顯著性，低劑量組和中劑量組差異無顯著性。缺氧/復(fù)氧激活了TLR4受體，梔子苷高劑組通過對TLR4受體的抑制發(fā)揮抗炎作用。

2.3TLR4、p-ERK1/2、p-IκB、p38的Western blot結(jié)果p-ERK1/2、p-IκB和 p38蛋白的表達對照組在梔子苷中劑組和高劑組與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.01)。說明梔子苷中劑組和高劑組是通過抑制ERK1/2、IκB和p38蛋白磷酸化激活而發(fā)揮作用的。

Fig 1 The expression of TLR4Mrna in microglia

Fig 2The expression of TLR4mRNA in microglia(±s，n=3)*P＜0.05 vs model

Fig 3 The expression of TLR4，p-ERK1/2，p-IκB、p38

2.4MyD88和NF-κB的免疫熒光雙染結(jié)果NF-κB p65的核移位是NF-κB活化的標(biāo)志，也是有關(guān)NF-κB生理病理變化的開始。從Fig 4中可以看出模型組和梔子苷低劑組的NF-κB p65在細(xì)胞核表達較高，對照組、梔子苷中劑組和高劑組與模型組比較主要表達在胞質(zhì)中，細(xì)胞核中較少。說明缺氧/復(fù)氧促使NF-κB p65磷酸化并進入核中，啟動轉(zhuǎn)錄活性。MyD88主要表達在胞質(zhì)中，模型組和梔子苷低劑組表達較高，對照組、梔子苷中劑組和高劑組與模型組比較較少，表達趨勢與NF-κB p65核轉(zhuǎn)位趨勢一致。

3 討論

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是天然免疫受體家族，目前發(fā)現(xiàn)的TLR家族蛋白有13種，其中Toll樣受體4(toll-likereceptor4，TLR4)是研究較為深入的受體，已證實TLRs在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達，且其表達程度受到缺氧、炎癥因子等一系列內(nèi)源性或外源性因素刺激的調(diào)節(jié)［2］，提示TLRs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥免疫反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。TLR4受體在腦缺血/再灌注過程中被激活［3］，在缺血/缺氧狀態(tài)下，腦組織中的一些內(nèi)源性介質(zhì)可以作為配體激活TLR4受體，例如熱休克蛋白(heat-shock proteins，HSP)，其中HSP70可以通過CD-14依賴方式激活TLR4受體來傳導(dǎo)促炎癥反應(yīng)信號，經(jīng)MyD88信號傳導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的分泌［4］。MyD88的啟動使其下游的I-κB迅速磷酸化激活，與NF-κB解離，NF-κB進入細(xì)胞核，與p38、ERK1/2磷酸化后激活的激活蛋白1(AP-1)共同作用促使細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8等的分泌，形成組織周圍的炎性反應(yīng)。本實驗通過對原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧實驗也證實缺氧/復(fù)氧激活了TLR4通路，模型組TLR4mRNA和蛋白較對照組均表達上調(diào)，通路下游 MyD88、p-IκB、p38 和 p-ERK1/2 磷酸化蛋白表達增多，NF-κBp65入核率增加，提示缺氧/復(fù)氧使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，通過MyD88的依賴TLR4通路發(fā)揮免疫作用。

Fig 4 The immunofluorescence double staining of MyD88 and NF-κBp65(×100)

梔子是藥食兩用傳統(tǒng)中藥，藥用梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實，性寒味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效。梔子苷是從梔子中提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物。國內(nèi)外研究顯示，梔子苷具有抗炎［5］、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、降壓、保肝利膽、抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶、保護缺血性腦神經(jīng)損傷等作用［6］。在對小膠質(zhì)細(xì)胞進行缺氧/復(fù)氧時，我們加入了終濃度分別為125、250和 500 μmol·L－1梔子苷，發(fā)現(xiàn)對于 TLR4mRNA 和TLR4蛋白只有 500 μmol·L－1與模型組比較差異有顯著性，而對于 MyD88、p-IκB 、NF-κB、p-ERK1/2和 p38 蛋白，梔子苷250 和500 μmol·L－1均表現(xiàn)出了抑制作用。其機制可能是缺氧/復(fù)氧使小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一些內(nèi)源性配體活化，在激活TLR4通路的同時也激活了TLRs的其他通路，如TLR2或TLR6等，這些通路也可依賴MyD88途徑激活下游蛋白(我們后期的實驗也證明了這一點，缺氧/復(fù)氧后TLR2和TLR6的mRNA和蛋白的表達增加)。因此，梔子苷抑制了缺氧/復(fù)氧引起的TLR4mRNA和通路蛋白的表達，進而抑制了一系列瀑布式級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮抗炎效應(yīng)。但通路之間的交叉串流使梔子苷治療腦缺血的機制更加復(fù)雜，有待于我們進一步實驗證實。

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