齊元麟，紀明開，2，謝 群，3，黃清玲，林建銀

(福建醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院分子醫(yī)學研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，2.附屬第一醫(yī)院皮膚科，福建 福州 350004;3.莆田學院醫(yī)學院，福建莆田 351100)

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑(sv-cystatin)是來自中華眼鏡蛇(Naja atra)蛇毒的活性成分［1］。本實驗室合成sv-cystatin全基因，采用兩種策略研究其功能:①在大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產重組sv-cystatin蛋白，純化蛋白質，研究其抗腫瘤活性［2］;②構建sv-cystatin真核表達載體，研究基因轉染對腫瘤細胞的影響［3－4］。在體內體外實驗中，兩種策略都顯示sv-cystatin可抑制小鼠黑素瘤B16細胞和人肝癌MHCC97H細胞的侵襲轉移。為進一步了解sv-cystatin抗腫瘤作用機制，我們采用基因芯片技術分析了sv-cystatin基因轉染對B16細胞基因表達譜的影響［5］。本研究在前期研究基礎上，采用比較蛋白質組學策略研究sv-cystatin轉染對B16F1細胞的蛋白質表達譜的影響，以雙向電泳分離蛋白質，以基質輔助激光解吸電離質譜法(MALDI-TOFMS)鑒定差異蛋白，結合前期基因組數據進行整合分析，探討sv-cystatin抑制腫瘤的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器IPGphorⅡ等電聚焦電泳儀、DALTsix垂直電泳槽、ImageScanner凝膠掃描儀均為 GE Healthcare產品;7500熒光定量PCR儀為Applied Biosystems產品。

1.1.2試劑固相 pH梯度(IPG)膠條(pH 3-11非線性，24 cm)、IPG緩沖液、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、硫脲、CHAPS、蛋白酶抑制劑混合物、蛋白定量試劑盒、二甲基甲酰胺等雙向電泳試劑均購自GE Healthcare;TRIzol、ECL化學發(fā)光液購自 Invitrogen;M-MLV逆轉錄酶、RNasin購自 Promega;SYBR Premix實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa;雞抗sv-cystatin單抗為上海中科開瑞公司產品;兔抗GAPDH、RhoGDI-beta和 NM23抗體均購自 Santa Cruz;HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自Cell Signaling;其余試劑均為進口或國產分析純。

1.2方法

1.2.1細胞株B16F1/pcDNA3.1和 B16F1/svcystatin細胞由本實驗室保存。B16F1/pcDNA3.1細胞為真核表達載體pcDNA3.1-His C轉染B16F1細胞后經G418篩選獲得;B16F1/sv-cystatin為包含完整sv-cystatin閱讀框的重組pcDNA3.1-His C載體轉染 B16F1 細胞后，G418 篩選所得［3－4］，該細胞高表達 sv-cystatin(見 Fig 1)，生長增殖能力與B16F1/pcDNA3.1無異，但體外侵襲和體內轉移能力低于B16F1/pcDNA3.1。

Fig 1 Western blot analysis of sv-cystatin overexpression

1.2.2細胞總蛋白的提取、雙向電泳與凝膠圖像分析［6］B16F1/pcDNA3.1和 B16F1/sv-cystatin細胞生長至對數生長期，胰酶消化，2×106細胞加入100 μl裂解緩沖液(7 mol·L－1尿素，2 mol·L－1硫脲，0.065 mol·L－1CHAPS，0.04 mol·L－1Tris HC1，0.04 mol·L－1二硫蘇糖醇，2% 兩性非線性電解質pH 3～11，1 μl廣譜蛋白酶抑制劑混合物)裂解細胞，40 000×g離心1 h吸取上清液，測定總蛋白濃度。按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)操作手冊對兩組蛋白樣品進行等電聚焦，并將聚焦結束后的IPG干膠條放人平衡液平衡，隨后灌制12.5%SDS-PAGE凝膠，在第二相Ettan DALTsix中對樣品進行垂直板電泳。實驗重復3次。凝膠經考馬斯亮藍R-350染色，Image Scanner掃描，用 Image Master 2D Platinum軟件分析蛋白差異點。

1.2.3質譜分析［7］手工切下包含蛋白的小塊凝膠。凝膠經脫色、酶解，在4700 Proteomics Analyzer(TOF/TOF)上進行MALDI-TOF-MS分析。肽質量指紋圖譜(PMF)質量掃描范圍為700～3 500 ku且強度最大的5個峰進行串級質譜分析。譜圖用myoglobin酶解肽段進行外標校正。所得結果用GPS(Applied Biosystems)和 MASCOT(Matrix Science)進行數據庫檢索，并結合專業(yè)知識進行蛋白的確認。

1.2.4Western blot驗證差異表達蛋白B16F1/pcDNA3.1和B16F1/sv-cystatin細胞經RIPA裂解液裂解后離心并保留上清液，測定上清液蛋白濃度。取等量40 μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉過夜。一抗4℃溫育24 h，二抗室溫溫育2 h，化學發(fā)光法檢測差異蛋白表達，以GAPDH基因為內參照，計算蛋白表達的相對變化。

1.2.5Realtime PCR驗證差異表達基因TRIzol一步法提取B16F1/pcDNA3.1和B16F1/sv-cystatin細胞總 RNA，按照常規(guī)方法逆轉錄，采用 SYBR Green法實時定量PCR分析各差異基因的mRNA表達，以 β-actin 基因為內參照，采用 2-ΔΔCt法計算基因表達的相對變化。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers for differential genes found by the proteomics analysis

1.2.6差異基因的Gene Ontology(GO)初步分析將本研究得到的差異蛋白質和前期基因芯片數據［5］合并，提交到 DAVID Bioinformatics Resources 6.7(National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)，NIH)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)［8］，根據 Gene Ontology(http://www.geneontology.org/)，對差異表達基因的功能、定位、途徑進行分析。

1.2.7統(tǒng)計學處理所有數據均采用 SPSS for Windows 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，各組數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1雙向凝膠電泳和差異蛋白點的篩選實驗對B16F1/pcDNA3.1和B16F1/sv-cystatin細胞的總蛋白進行了雙向凝膠電泳分離，Fig 2是其中具有代表性的背景清晰、分辨率高的圖譜。經過Image Master 2D Platinum分析，在 B16F1/pcDNA3.1組上找到(724±27)個蛋白點，B16F1/sv-cystatin組上找到(665±40)個點，兩組圖的匹配蛋白點有(412±20)個。與對照組相比，B16F1/sv-cystatin組有5個蛋白表達上調2倍、6個蛋白表達下調2倍以上。我們選擇了這11個蛋白點，同時也選擇了1個在B16F1/sv-cystatin特異表達的蛋白點進行質譜鑒定，選擇的蛋白點見Fig 2。

Tab 2 The differential proteins identified by MALDI-TOF-MS analysis

Fig 2 2D eletrophoresis spectrum of B16F1/pcDNA3.1 or B16F1/sv-cystatin cell extracts

2.2蛋白質質譜鑒定12個差異蛋白點經過膠內酶解提取蛋白肽段進行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定，所得m/z數據經數據庫(http://www.matrixscience.com 和 http://cn.expasy.org/sprot)搜索分析，其中10個差異表達蛋白的Protein Score在100分以上，結果予以采信。它們按功能可以分為糖代謝酶系、小G蛋白調控分子、真核翻譯因子、核苷酸激酶等，詳見Tab 2，而G4和H3兩個蛋白的Protein Score低于50，結果不予采信。

2.3差異基因的Western blot和Real time PCR驗證采用Western blot鑒定了NM23和RhoGDI-beta的表達，以GAPDH為內參照，結果顯示，與對照組相比，B16F1/sv-cystatin細胞的NM23和RhoGDI-beta的蛋白表達分別上調了(2.23±0.34)倍和(1.57±0.11)倍，與蛋白質組學結果相符。結果見Fig 3。

為探討差異表達蛋白在mRNA上表達的變化，我們采用Real time PCR驗證了8個差異表達蛋白質的mRNA的表達水平，結果顯示，與對照組相比，B16F1/sv-cystatin 細胞的 NM23、RhoGDI-beta、RANBP1的 mRNA 表達上調，eIF5A、MDH1、eEF1-beta2表達下調，與蛋白質表達趨勢一致，說明這些蛋白表達改變與其基因轉錄水平改變有關;RhoGDI-alpha和Prdx2的轉錄水平沒有明顯變化，與其蛋白表達趨勢不完全一致，說明其蛋白表達和基因轉錄水平存在一定差異。結果見Fig 4。

Fig 3 Western blot analysis of differentially expressed proteins

Fig 4 Realtime PCR analysis of differentially expressed genes

2.4差異基因的Gene Ontology分析我們將前期報道的sv-cystatin的差異基因組學數據和上述差異蛋白組學數據整合，進行了分子功能注釋，通過GO分析，從細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biological process)3個角度對它們進行了分類，詳見Tab 3。

Tab 3 The gene ontology annotation of differentially expressed genes

3 討論

本研究結果初步顯示sv-cystatin可以影響B(tài)16F1的蛋白質表達譜，這些差異表達蛋白主要與腫瘤轉移、小G蛋白調節(jié)、翻譯和代謝等生理過程相關。

以往研究中我們發(fā)現重組sv-cystatin蛋白處理或基因轉染均可抑制小鼠黑素瘤B16、人肝癌MHCC97H 和人胃癌 SGC7901的侵襲和轉移［2－4］，并發(fā)現這與sv-cystatin抑制腫瘤細胞分泌的半胱氨酸蛋白酶［2］以及下調細胞表面黏附分子如 Laminin等［4－5］有關。本研究顯示，sv-cystatin能明顯上調抑癌蛋白NM23的表達，這可能是sv-cystatin抑制腫瘤轉移的另一機制。NM23是Steeg等從小鼠黑素瘤細胞中篩選到的抑癌蛋白，由Nme1基因編碼，它在低轉移細胞株中的表達是高轉移細胞株中的10倍，與腫瘤轉移密切相關［9］。NM23是一種核苷二磷酸激酶，可以催化γ-磷酸基團在NTP和NDP之間的轉移，并能結合DNA和調節(jié)轉錄。許多研究顯示，NM23可通過催化GDP-GTP交換反應而激活各種小G蛋白和三聚體G蛋白而激活信號轉導，此外，NM23還能與Tubulin結合，通過調節(jié)微管結構而影響細胞的結構和遷移，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移［10］。本研究中雙向電泳凝膠染色和Westernblot都顯示B16F1/sv-cystatin細胞的NM23相比對照組上調超過100%，而RT-PCR分析顯示NM23的mRNA表達也上調，說明上調NM23表達很可能是sv-cystatin抑制腫瘤轉移的機制之一。

Rho是Ras超家族小G蛋白的一員，在信號轉導中作用于肌動蛋白，調控細胞的運動與遷移。有研究表明Rho在多種腫瘤中表達異常，并與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關。Rho GDP解離抑制因子(Rho GDP dissociation inhibitor，RhoGDI)可阻止GDP從Rho酶上分離，抑制Rho的激活，從而發(fā)揮抑制腫瘤轉移的作用［11］。?；蹚┑龋?2］發(fā)現，RhoGDI2蛋白在肺癌組織中表達較癌旁組織降低，且與組織分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關。組織分化程度低，臨床分期晚，有淋巴結轉移的患者，RhoGDI2蛋白表達明顯降低，提示RhoGDI2與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移有關。本研究發(fā)現RhoGDI-beta(在人類中為RhoGDI2)在B16F1/sv-cystatin中高表達，推測可能與sv-cystatin抑制腫瘤侵襲轉移有關。真核翻譯起始因子5A(eIF5A)和真核翻譯延長因子1-β(eEF1-beta2)都是非常保守的蛋白質，在翻譯過程起重要作用，并參與調節(jié)細胞增殖和凋亡。本研究發(fā)現 sv-cystatin可下調 eIF5A和eEF1-beta2，從而抑制蛋白質合成，推測與其抑制細胞增殖的活力有關。本研究結果還顯示，sv-cystatin可影響糖代謝酶系、氧化還原蛋白的表達，這些蛋白變化的確切機制和意義有待進一步研究。

本課題組前期采用基因芯片分析sv-cystatin對B16細胞mRNA表達的影響，篩選得到45個差異表達基因，其中21個上調，24個下調［5］。本研究分析sv-cystatin對B16細胞蛋白質表達譜的影響，篩選了10個差異蛋白，這些蛋白與基因芯片鑒定的結果沒有明確的對應關系。這種轉錄組數據和蛋白質組數據不匹配的結果在國內外研究中都有發(fā)現，如Chen等［13］同時采用基因芯片和蛋白質組學對肺癌樣本的研究發(fā)現，在鑒定的165個蛋白點中只有17%的mRNA和蛋白質表達趨勢在統(tǒng)計學上明顯相關，而83%的mRNA和蛋白質表達不相關甚至相反(如α-結合珠蛋白)［13］。其他文獻也指出，轉錄組和蛋白組的Pearson相關系數分布在0.46到0.76之間，說明mRNA表達量對于蛋白質豐度只能提供微弱的提示［14］。一般認為，引起這種不匹配的原因是高等動物存在復雜的轉錄后調控機制，如mRNA/蛋白穩(wěn)定性調節(jié)、翻譯起始控制、轉錄后基因沉默等。為探討本研究鑒定的差異蛋白與相應mRNA表達的關系，我們采用實時定量PCR檢測差異蛋白的轉錄本含量。結果顯示，在檢測的8個基因中，有6個的mRNA表達趨勢和蛋白表達趨勢一致，兩個不一致，說明我們鑒定的差異蛋白大多與mRNA表達趨勢存在相關性。但是，這些基因的mRNA表達變化幅度普遍低于蛋白質變化幅度，都低于基因芯片篩選的閾值(表達變化2倍以上)，所以前期基因芯片實驗沒有篩選出這些基因。另一方面，目前基于雙向電泳-質譜的蛋白質組學技術對偏性蛋白、膜蛋白、低豐度蛋白的分離和定量都存在一定難度［14］，也使蛋白質組提供的信息量低于轉錄組，我們前期基因芯片鑒定的差異基因許多都編碼疏水的質膜受體或低表達，它們被雙向電泳分離并被我們篩選得到的概率較低。

轉錄組和蛋白質組研究手段差異很大，結果的相關性也并不高，但是它們都提供了特定層次上的基因表達情況，對轉錄組和蛋白組數據進行整合分析，有利于獲得基因表達變化的“全景圖”［15］，因此，本研究利用美國NIH的DAVID生物信息學分析平臺(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID)［8］對基因芯片數據和蛋白組數據進行了初步功能注釋和分類。Gene Ontology(基因本體學，GO)是生物信息學領域中一個極為重要的方法和工具，它通過對基因序列的注釋，推斷序列編碼產物的功能，已廣泛用于大規(guī)模組學的數據整合和利用［16］。我們通過DAVID平臺，對數據進行了GO分類和注釋，結果顯示，sv-cystatin轉染導致差異變化基因的細胞定位(cellular component)主要分布在細胞間質、質膜和細胞核;分子功能(molecular function)則表現為DNA結合能力、轉錄因子活性和半胱氨酸蛋白酶;參與的生物過程(biological process)主要有細胞凋亡、胚胎成形和DNA轉錄調控。因此，我們初步認為，sv-cystatin的主要作用靶點蛋白可能分為幾類:①細胞核的轉錄因子，調控基因表達;② 內源或分泌型半胱氨酸蛋白酶，與調節(jié)細胞遷移和細胞凋亡有關;③ 質膜受體，與信號轉導有關。雖然這只是較為粗淺層次的數據整合分析，但它對進一步研究sv-cystatin作用機制指出了新方向。

目前，采用蛋白質組學研究藥物作用機制的報道越來越多［17］，蛇毒蛋白功能復雜多樣，采用蛋白質組學研究其功能，對從整體水平上理解它們的作用機制十分有利。本研究應用蛋白質組學技術，發(fā)現NM23、RhoGDI-beta等10個與sv-cystatin抗黑色素瘤活性相關的差異蛋白;通過Gene Ontology分析提示sv-cystatin的主要靶分子可能是轉錄因子、分泌蛋白和質膜受體。這些結果為進一步探討sv-cystatin抗腫瘤作用的分子機制及其作為抗腫瘤藥物的開發(fā)應用提供了理論基礎和實驗依據。

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