姚玲玲，黃曉偉，朱依純

(復旦大學上海醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 200032)

心肌細胞凋亡是心臟缺血/再灌注(I/R)損傷中導致心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的原因之一。例如，在慢性心肌缺血(尚未達到心肌梗死的程度)區(qū)域，或在急性心肌梗死的梗死區(qū)周邊，甚至在急性心肌梗死早期的梗死區(qū)，常伴有程度不等的心肌細胞凋亡［1－2］。尋求能夠抗心肌細胞凋亡的藥物和干預手段成為心血管臨床和基礎(chǔ)研究的一個主要領(lǐng)域。因此，本研究擬通過離體和在體心肌細胞凋亡模型的建立，對其基本特征進行評價，為心肌梗死機制的研究以及保護心肌藥物的篩選提供合適的離體和在體模型。

1 材料與方法

1.1動物Sprague-Dawieg(SD)大鼠，出生1～2 d;♂ WKY大鼠8只，體質(zhì)量140～160 g，均購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2主要試劑及儀器細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12)購自Sigma公司;0.1%胰蛋白酶和胎牛血清購自Gibco公司;TUNEL試劑盒購自Roche公司。DHX-150小動物呼吸機購自成都儀器廠。

1.3模型的建立離體細胞凋亡模型:1～2 d的SD大鼠15～20只，消毒皮膚后剪開胸廓，取下心臟，剪成1 mm3的碎塊，0.1%胰酶37℃水浴中預消化10 min，自然沉淀棄上清，重復1次;加入10～15 ml 0.1%胰酶，37℃水浴攪拌15 min后取上清，5%特級小牛血清終止消化，1 500 r·min－1離心3 min后棄上清得細胞沉淀，2 ml完全培養(yǎng)液(DF12，10%小牛血清)使細胞重懸，重復這一消化步驟3～4次，收集所有的細胞懸液，混勻置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，小心吸出未貼壁細胞，調(diào)整細胞密度至5×108個·L－1接種培養(yǎng)。心肌細胞培養(yǎng)24 h后用無糖無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基換成Hank's平衡液后，將細胞放在37℃、95%氮氣－5%CO2的環(huán)境中30 min，再重新放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。

在體心肌梗死細胞凋亡模型:大鼠稱重后腹腔注射6%水合氯醛溶液5×10－3L·g－1，麻醉，仰臥固定，氣管插管，連呼吸機，備皮，以心尖搏動最強的點為中心，作一橫行切口，長度3～5 cm，顯露肋骨，由第4肋間入胸暴露心臟，從左心耳下方2～3 mm入針，縫扎，在結(jié)扎的時候放入一小段PE管，以備再灌注的時候用。結(jié)扎30 min后，將小PE管取出，進行再灌注2 h。

1.4觀察的指標及檢測方法

1.4.1TUNEL法測原代培養(yǎng)細胞凋亡情況將種有細胞的蓋玻片放在固定液中室溫固定20 min，通透液中(0.2%TitonX-100，3%枸櫞酸鈉的PBS溶液)冰上通透2 min，每片加50 μl TUNEL反應液濕盒中37℃ 60 min避光孵育，PBS中洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長488 nm，接受波長530 nm。

1.4.2TUNEL法測梗死心肌周邊區(qū)凋亡細胞直接將心臟取出，PBS中洗去血液，放入4%多聚甲醛中過夜，30%蔗糖中脫水至心臟下沉，進行冰凍切片，TUNEL染色，觀察拍照。

1.4.3凋亡細胞DNA的檢測細胞用PBS洗3次，胰酶消化，離心，取沉淀，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，溶解于30 μl TE中。瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min后凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.5統(tǒng)計學方法用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果均以±s表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞凋亡缺氧30 min復氧2 h引起原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞凋亡，TUNEL染色呈現(xiàn)大量陽性細胞(Fig 1，F(xiàn)ig 2)。

Fig 1 Hypoxia/rexygen-induced cardiomyocyte apoptosis measured with TUNEL staining

Fig 2 Hypoxia/reoxygen-induced cardiomyocyte apoptosis

2.2 DNA ladder檢測DNA凝膠電泳結(jié)果顯示凋亡誘導組細胞呈現(xiàn)明顯的帶狀條紋，經(jīng)檢測后為180 bp的倍數(shù)，而對照組只有一條大分子量的DNA條帶。見Fig 3。

Fig 3 Hypoxia/reoxygen-induced cardiomyocyte DNA ladder production

2.3心梗模型造成的大鼠心肌細胞凋亡心臟缺血30 min，再灌注2 h后進行心臟冰凍切片的TUNEL染色看到大量凋亡細胞(見Fig 4)。

Fig 4 Ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte apoptosis in the area of risk in vivo

3 討論

心肌梗死是嚴重危害人類健康的疾病，利用溶栓療法、血管重建等方法的應用，可使缺血心肌恢復血流再灌注。但是缺血心肌功能未必恢復，有時反而損傷加重，心肌細胞凋亡在缺血/再灌注損傷中的作用長期以來受到關(guān)注，如何保護心肌細胞，減少凋亡細胞的數(shù)量，減小梗死周邊危險區(qū)(area of risk)成為心血管領(lǐng)域研究的熱點。體外培養(yǎng)時誘導心肌細胞凋亡的方法主要有藥物誘導和物理誘導兩種。藥物誘導有應用代謝抑制的藥如2-deoxy-D-glucose［3］或Fas凋亡通路激活藥物actinomycin D［4］，或者應用離子通道阻斷劑，如氯離子通道阻斷劑staurosporine誘導心肌細胞凋亡［5］等;而物理誘導主要有缺氧和營養(yǎng)剝奪兩種，臨床上心肌梗死發(fā)生時，心肌細胞同時受到缺氧和營養(yǎng)剝奪兩種傷害，而這兩種刺激因素對心肌細胞的損害不完全相同，我們采用的缺氧/復氧處理法就是一種綜合營養(yǎng)剝奪和缺氧刺激的方法，這種處理能夠快速造成心肌細胞凋亡，有利于我們觀察到藥物對心肌細胞凋亡的干預作用，譬如可以在細胞進行缺氧處理前給予藥物預處理一段時間，再進行缺氧/復氧損傷，觀察藥物的作用。

大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎造成心肌梗死的模型現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛采用［6－7］。這是一種急性梗死的模型，相對于用動脈環(huán)造成的慢性心肌缺血模型，其動物來源方便(慢性心肌缺血模型多在小型豬身上制作)，操作便捷，造價低廉，可重復性強，缺血30 min，再灌注2 h后，在梗死灶周邊區(qū)有大量凋亡細胞的存在，如何保護這些凋亡細胞，逆轉(zhuǎn)其凋亡的通路，恢復其功能是值得探索的很有價值和意義的課題。

綜上所述，原代心肌細胞缺氧/復氧損傷引發(fā)的凋亡模型和在體大鼠缺血/再灌注損傷引發(fā)的細胞凋亡模型具有操作簡單、成功率高等特點，可以用于心肌梗死機制的研究以及保護心肌藥物的篩選。

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