龔 敏，梁鑫淼，崔曉楠

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011;2.中科院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023)

目前化療藥物對(duì)肝癌有效率不超過20%［1］。靶向藥物，如sorofenib、erlotinib等未能改變肝癌治療現(xiàn)狀［2］。因而探索高效低毒的抗肝癌藥物歷來是醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)。欖香烯(elemene，ELE)是從活血化瘀中藥姜科植物溫莪術(shù)中提取出的抗癌活性單體，研究表明 ELE對(duì)多種腫瘤具有抑制作用［3－5］，表現(xiàn)出高效低毒的中藥特質(zhì)，尤其對(duì)肝癌顯示出良好臨床療效［7］。然而，其機(jī)制有待深入研究。TOPOⅠ、TOPOⅡ是調(diào)節(jié)核酸拓?fù)錁?gòu)型的關(guān)鍵酶，已成為抗癌藥物研究的重要靶點(diǎn)之一［9］，目前關(guān)于ELE對(duì)TOPOⅠ、TOPOⅡ的作用機(jī)制未見報(bào)道。本研究觀察了ELE對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及TOPOⅠ、TOPOⅡ表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株HepG-2(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代、保存);ELE(大連金港制藥有限公司，批號(hào)0508031);MTT(Biosharp公司);AnnexinV試劑盒(美國(guó)Molecular Probes公司);RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);PCR擴(kuò)增引物(由大連寶生物工程有限公司合成);碘化丙啶(Sigma公司);溴化乙錠(Amresco公司);TRIzol試劑盒(Invitrogen公司);氯仿、異丙醇、乙醇(均為國(guó)產(chǎn)分析純);十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺(美國(guó)Sigma公司);甘氨酸(上海生工生物工程技術(shù)有限公司);1 mol·L－1Tris(pH 6.8)、1.5 mol·L－1Tris(pH 8.8)和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)(凱基生物有限公司);兔抗人TOPOⅠ多克隆抗體(sc-10783)，兔抗人TOPOⅡ多克隆抗體(sc-13059)(Santa Cruz公司);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗(河北博海生物工程有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將HepG-2細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的低糖IMDM培養(yǎng)基中。孵箱的培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2，37℃，飽和濕度。每?jī)商旄鼡Q1次培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底約90%，用質(zhì)量濃度為2.5 g·L－1胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察設(shè)對(duì)照組和ELE(20、40、60、80、100 mg·L－1)濃度組。細(xì)胞接種在 6 孔板上，作用72 h后，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察HepG-2細(xì)胞形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖96孔板中每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞100 μl。分對(duì)照組、藥物 ELE(20、40、60、80、100、120、140、160、180 及 200 mg·L－1)10個(gè)濃度組，培養(yǎng)時(shí)間分別24、48、72 h，每組8個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MTT 試驗(yàn)，每孔加入 MTT 液(5 g·L－1)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩 6 min，用酶標(biāo)儀 570 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)，根據(jù)A值計(jì)算抑制率。抑制率(IR)/%=(1－試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞抑制率為縱軸，根據(jù)量效曲線計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按5×108個(gè)·L－1濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度為20、40、60 mg·L－1)，分別作用24、48 h收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2遍，1×Binding buffer調(diào)整細(xì)胞至1 ×109·L－1余按試劑盒說明書操作，在流式細(xì)胞儀(FCM)上對(duì)細(xì)胞凋亡及死亡進(jìn)行熒光檢測(cè)和分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測(cè)TOPOⅠ、TOPOⅡmRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)濃度至5×108·L－1接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度為20、40、60 mg·L－1)，培養(yǎng) 48 h 后收集各組細(xì)胞。用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。RT-PCR步驟按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進(jìn)行，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參照。β-actin引物大小為404 bp，上游引物5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3';下游引物:5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。TopoⅠ引物大小為565 bp:上游引物:5'-CGCTATCCTGAAGGCATCAA-3';下游引物:5'-CTGGAGGAGGAGAAGGAACC-3'。TopoⅡ引物大小為233 bp:上游引物:5'-CTTGTACTGCAGACCCACA-3';下游引物:5'-ATAATAGAATCAAGGGAATTCCCAAGTC-3'。將PCR產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓控制在90 V，UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、拍照、分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測(cè)TOPOⅠ、TOPO II蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)濃度至5×108·L－1接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度為20、40、60 mg·L－1)，培養(yǎng) 48 h 后，吸掉培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS沖洗3次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，用8%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。封閉液室溫封閉1 h，按適當(dāng)比例加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，按1∶3 000的稀釋倍數(shù)加入辣根酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，用ECL顯色并曝光于X膠片。將底片掃描，并用Image J軟件的圖像分析儀分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以ˉx+s表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)分析采用單因素方差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1ELE對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制形態(tài)學(xué)觀察在倒置光學(xué)顯微鏡下，觀察到ElE在體外可以明顯抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)72 h后對(duì)照組細(xì)胞為貼壁的梭形細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密。而加入不同濃度的ELE干預(yù)的HepG-2細(xì)胞，隨著濃度增加，細(xì)胞體積逐級(jí)縮小，胞膜皺折，核漿比例減小，核邊聚伴有碎裂，原來堆積成團(tuán)的HepG-2細(xì)胞結(jié)合力下降，松散成個(gè)體漂浮，散在分布。視野內(nèi)可見細(xì)胞崩解碎片增多(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ELE on cell morphology of human hepatocellular carcinoma HepG-2(×40)

2.2MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)隨著藥物濃度增加，細(xì)胞增殖能力逐漸下降，表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性;藥物作用24、48和72 h后，IC50值分別為96.13、80.84、60.95 mg·L－1(Fig 2)。

Fig 2 Inhibitory effect of ELE on proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells

2.3ElE對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡的作用不同濃度的ELE分別作用于HepG-2細(xì)胞24、48 h，應(yīng)用AnnexinV和PI染色后，F(xiàn)CM分析細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，藥物組凋亡細(xì)胞比例增高，表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性(Tab 1，F(xiàn)ig 3)。

Tab 1 ELE dose-dependent apoptosis rate(48 h，% ，±s，n=3)

Tab 1 ELE dose-dependent apoptosis rate(48 h，% ，±s，n=3)

ELE concentrations Late apoptosis Early apoptosis Total apoptotic ratio Necrotic ratio Negative control 0.49 ±0.17 0.58 ±0.19 1.07 ±0.35 0.44 ±0.18 60 mg·L －1 14.03 ±1.08 20.36 ±1.92 34.38 ±2.61 8.38 ±1.27 40 mg·L －1 12.23 ±0.52 14.91 ±1.38 27.14 ±0.87 6.63 ±0.78 20 mg·L －16.24 ±0.88 8.45 ±1.15 14.69 ±1.77 3.23 ±0.82

Fig 3 Effect of ELE on apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells

2.4 ELE對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞TOPOⅠ和TOPOⅡmRNA表達(dá)的影響ELE作用48 h后TOPOI mRNA、TOPOⅡmRNA的表達(dá)隨藥物濃度的升高表達(dá)降低。實(shí)驗(yàn)組(ELE濃度分別為20、40、60 mg·L－1)，TOPOⅠmRNA 與 β-actin mRNA 光密度比值(0.84±0.08、0.68±0.01、0.58±0.04)明顯低于對(duì)照組(1.10±0.06)(P＜0.05);TOPOⅡmRNA與β-actin mRNA光密度比值(0.93±0.03、0.71±0.03、0.57±0.02)明顯低于對(duì)照組(1.18±0.03)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ、TOPOⅡ轉(zhuǎn)錄，并呈劑量依賴性(Fig 4)。

2.5Western blot檢測(cè)結(jié)果隨著給藥物組ELE濃度的增高，TOPOⅠ蛋白，TOPOⅡ蛋白表達(dá)降低。20、40、60 mg·L－1濃度的 ELE 作用人肝癌 HepG-2細(xì)胞48 h后，TOPOⅠ蛋白與β-actin蛋白條帶的光密度比值為(0.960±0.036、0.759±0.034、0.591±0.049)明顯低于對(duì)照組(1.161±0.043)(P＜0.05);TOPOⅡ蛋白與β-actin蛋白條帶的光密度比值(0.937±0.029、0.752±0.015、0.600±0.017)明顯低于對(duì)照組(1.134±0.045)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ蛋白，TOPOⅡ蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性(Fig 5)。

3 討論

從天然藥物中篩選高效低毒的抗腫瘤藥物是獲取抗腫瘤藥物的基本策略。ELE是祖國(guó)傳統(tǒng)中藥溫莪術(shù)中提取的抗癌單體，臨床抗腫瘤療效評(píng)價(jià)良好，尤其對(duì)化療非敏感腫瘤肝癌表現(xiàn)出抑癌效果［5－7］?；A(chǔ)研究表明ELE能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［8］，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，干擾信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等多靶位抗腫瘤作用。然而有關(guān)ELE對(duì)TOPO酶的作用未見報(bào)道。

拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO)是一種通過調(diào)節(jié)核酸空間動(dòng)態(tài)變化從而控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶，分為TOPOI型和TOPOⅡ型兩種類型，通過干擾TOPOⅠ和(或)TOPOⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是目前抗癌藥物的重要作用機(jī)制［9］。一線抗腫瘤藥物羥基喜樹堿、拓?fù)涮婵岛鸵亮⑻婵凳且訲OPOⅠ為靶位;依托泊苷和替尼泊苷是以TOPOⅡ?yàn)榘形粚?shí)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥效機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)ELE能夠抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，呈時(shí)間與劑量依賴性。誘導(dǎo)凋亡是藥物實(shí)現(xiàn)腫瘤殺傷的重要途徑，抗腫瘤藥物通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡過程。有別于經(jīng)典的抗肝癌藥物，如一線抗肝癌藥物順鉑通過在大分子水平上直接破壞DNA的雙鏈;氟尿嘧啶通過在小分子水平上阻斷DNA的合成，進(jìn)而啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡程序，我們的實(shí)驗(yàn)表明ELE能夠下調(diào)TOPOⅠ、TOPOⅡmRNA和蛋白的表達(dá)。因此，提示ELE抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能是通過下調(diào)TOPOⅠ、TOPOⅡ表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)藥效機(jī)制。研究表明ELE能夠影響肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、熱休克蛋白及其相關(guān)調(diào)控因子基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲等［10－13］，表現(xiàn)為多靶位的抗肝癌作用，然而，有關(guān)ELE對(duì)TOPO酶的影響未見報(bào)道。我們的研究首次表明干擾TOPOⅠ、TOPOⅡ表達(dá)可能為ELE抑制肝癌的作用靶位，ELE是值得關(guān)注的抗肝癌藥物。

Fig 4 TOPOⅠmRNA and TOPOⅡmRNA expressions of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

Fig 5 TOPOⅠprotein and TOPOⅡprotein expressions of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

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