綿陽麥冬1H-NMR主成分分析暨質(zhì)量控制研究

江洪波 姜建輝 田仁君 文登福 楊潔

麥冬為百合科植物麥冬[Ophiopogonjaponicus(Thunb.) Ker-Gawl.]的干燥塊根[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為常用中藥之一。綿陽是中國麥冬的主產(chǎn)區(qū)之一，但麥冬品種品質(zhì)復(fù)雜，區(qū)分綿陽產(chǎn)區(qū)各種不同麥冬，找出區(qū)分道地綿產(chǎn)麥冬及建立其道地標(biāo)準(zhǔn)有著現(xiàn)實意義。綿陽產(chǎn)麥冬的差異包括：種植區(qū)域不同，品種差異，炮制儲藏方法不同，不同的年份等，這種差異會體現(xiàn)在麥冬中所含的化學(xué)成分的種類和相對含量的不同。本文通過1H-NMR譜，以中國藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)麥冬為參照，對綿產(chǎn)新麥冬特等品、陳年麥冬、硫熏麥冬等的主要化學(xué)成分為研究對象，采用主成分分析方法進行比較分析研究。

1 材料與方法

1.1 麥冬樣品的來源

本試驗的麥冬樣品來源如表1所示。FM和MM組是原產(chǎn)綿陽，后移種于彭洲，F(xiàn)M為正宗O.japonicus(Thunb.) Ker-Gawl.，而MM則為一新變種O.japonicus(Thunb.)Ker.Gawl.cv.Mianyangensis；MD組采于2007年四川綿陽；H組采于2009年綿陽花園鎮(zhèn)，H-5、H-6、H-27均為顆粒飽滿的特級品，且未被硫熏過，H-18為一級品，顆粒較?。籊組采于2009年綿陽光明鎮(zhèn)，且均被硫熏過。

表1 麥冬樣品來源

1.2 儀器和試劑

Sartorius BS 224 s電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SENCOR-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀；W201D恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)；Bruker AV II-600核磁共振儀； 氘代二甲亞砜-d6(DMSO-d6)(ARMAR chemicals)；分析純甲醇。

數(shù)據(jù)分析軟件：Mestre-C；Excel；SIMCA-P 11.0。

1.3 方法

稱取剪碎的麥冬樣品2 g，加入甲醇(每次20 ml)，50℃水浴溫浸提取三次，每次1小時；合并濾液，減壓濃縮至干。稱取0.05 g提取物，用0.5 ml DMSO-d6溶解，制得供1H-NMR譜測定樣品溶液。測定獲得的各樣品的自由衰減(FID)信號，導(dǎo)入MestRe-C軟件，以每0.01化學(xué)位移值單位對各樣品1H-NMR圖譜進行分段積分，即得到每個樣本的各化學(xué)位移值段與相對應(yīng)的信號峰面積積分值(每張圖譜共有約1000積分值)。本試驗共26個樣本，即構(gòu)成26×1000數(shù)據(jù)矩陣，然后用SIMCA-P 11.0軟件分析。

1.4 分析測試方法的考察

參照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅧA 《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則》的要求，本試驗采用夾角余弦[2]作為判斷指標(biāo)。

樣品制備方法重現(xiàn)性考察：取標(biāo)準(zhǔn)麥冬5份 ，按1.3項下方法分別制備 5 份供試液，測定1H-NMR圖譜，得到5組積分值數(shù)據(jù)。以第一份樣品的數(shù)據(jù)為對照，計算5份樣品之間的夾角余弦值分別為1.000、0.9993、0.9995、0.9989、0.9994。計算值均為0.998以上，說明該實驗所用樣品制備方法具有良好的重現(xiàn)性。

核磁共振儀穩(wěn)定性及圖譜處理方法重現(xiàn)性考察：取標(biāo)準(zhǔn)麥冬1份，按 1.3項下方法制備供試液，連續(xù)測定5次，得到5組數(shù)據(jù)。以第一組測定數(shù)據(jù)為對照，計算5組數(shù)據(jù)之間的夾角余弦值分別為1.000、0.9996、0.9992、0.9995、0.9994。計算值均在0.999以上，說明該實驗所用核磁共振儀穩(wěn)定性以及圖譜處理方法重現(xiàn)性良好。

2 結(jié)果與分析

通過SIMCA-P 11.0進行主成分分析，由軟件根據(jù)規(guī)則計算所得，選取了主成分1，2，3，它們分別代表了麥冬樣品信息含量的40.17%，17.55%，11.44%，也就是全部1H-NMR圖譜信息的70%，可以基本反應(yīng)麥冬甲醇提取物的內(nèi)在化學(xué)成分種類和相對含量的信息。主成分分析結(jié)果的不同，將是不同麥冬內(nèi)在化學(xué)成分種類和相對含量的差異的體現(xiàn)。

2.1 主成分1和主成分2的分析圖譜

從主成分1和主成分2的分析圖譜(圖1)可以看到樣品主要聚集三個區(qū)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。在區(qū)域Ⅰ內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)麥冬BM組、09年綿陽花園鎮(zhèn)麥冬H組、07年麥冬MD組和涪麥冬F(xiàn)M組中的一部分。這說明它們之間有很大的相似性(均為同一個品種)，但MD、H、BM和FM組之間在區(qū)域Ⅰ內(nèi)仍可區(qū)分，說明它們之間也有一定差異，這個可能和它們的產(chǎn)地及年份不同有關(guān)。BM產(chǎn)于江浙，F(xiàn)M產(chǎn)自彭洲，H和MD產(chǎn)于綿陽。H組和MD組雖然品種、產(chǎn)地均相同，但年份不同，H是09年樣品，而MD是07年樣品。

區(qū)域Ⅱ內(nèi)的是MM組和部分G組，說明主成分1和2包含的這兩組信息相似性很大。MM和區(qū)域Ⅰ內(nèi)的樣品不是同一個品種，所以很容易區(qū)分解釋。而G組的G-11和G-12是經(jīng)過硫熏過的樣品也可以區(qū)分和解釋。而區(qū)域Ⅲ中的樣品可能是由于其它的原因和區(qū)域Ⅰ、Ⅱ有顯著差異，說明主成分1和2包含的信息顯著區(qū)別于區(qū)域Ⅰ、Ⅱ內(nèi)的樣品，至于是哪些具體的化學(xué)成分和含量的差異有待進一步研究。

主成分1和2所包含的信息量可以將同一來源的品種較好的聚集在一起，也就是它們所含的化學(xué)成分種類和含量有一定的相似性，如BM(1，2，3，4，5)、MD(2，3，4，5)、FM(1，2，4)、MM(1，2，3，5)、G(11.12)、H(5，6，27)等。MM-3在Ⅰ區(qū)， MD-1在Ⅱ區(qū)，表明同一來源的樣品中也有一些品質(zhì)相差較大的樣品。

圖1 主成分1和主成分2分析圖譜

2.2 主成分1和主成分3的分析圖譜

從主成分1和主成分3的分析圖譜(圖2)可以看到樣品被分為了上下兩個大的部分(虛線)，上面A部分均是樣品采集較早的麥冬，而下面B部分均來自09年的綿陽麥冬，即主成分3可以區(qū)分樣品的新陳。在B區(qū)域還可以看到，09年產(chǎn)綿陽麥冬，沒有經(jīng)過硫熏，且顆粒飽滿的特等品H-5、H-6和H-27聚集在一起，能顯著區(qū)別于硫熏過的G組，而H-18在G組區(qū)域，說明H-18很有可能被硫熏過。

主成分1和3所包含的信息量同樣可以將同一來源的品種較好的聚集在一起，而且區(qū)分度更好，如BM(1，2，3，4，5)、MD(2，3，4，5)、FM(1，2，4)、MM(1，2，3，5)、H(5，6，27)聚集度更加集中。主成分1和3可以區(qū)別出樣品年代和是否被硫熏過。

圖2 主成分1和主成分3分析圖譜

3 討論

通過以上分析可知，可以通過麥冬1H-NMR-PCA模式識別的方法把綿陽產(chǎn)麥冬和其它地區(qū)的麥冬進行區(qū)分，可以將不同品種的綿陽麥冬進行區(qū)分，可以將是否經(jīng)過硫熏的麥冬區(qū)分出來。因為不同品種、不同產(chǎn)地、不同年代、不同炮制方法得到的麥冬，它們的內(nèi)在化學(xué)成分的種類和相對含量必然存在著差異，至于是什么具體的化學(xué)成分導(dǎo)致這些差異，還有待進一步研究。

在主成分1和3分析圖譜中，H-5、H-6和H-27三個樣品聚集區(qū)顯著區(qū)別于其它樣品(圖2)，如果以H-5、H-6和H-27特級品為綿陽道地麥冬的標(biāo)準(zhǔn)品，通過1H-NMR主成分分析-模式識別的方法就可以在一定程度上保證綿陽麥冬的道地性，是麥冬內(nèi)在質(zhì)量(化學(xué)成分種類和含量)控制的一種有效手段。

1H-NMR圖譜理論上可以提供樣品中所有含氫有機化合物的信息，所以可以較為全面的反應(yīng)中藥提取物中的化學(xué)成分和相對含量。主成分分析法(PCA)能從1H-NMR譜大量二維數(shù)據(jù)中獲得具有統(tǒng)計學(xué)意義，綜合的化學(xué)成分信息，PCA方法是最簡單、最常用且比較有效的無監(jiān)督方法 ，其原理是通過線性變換 ，將原來的多變量組合成相互獨立的少數(shù)幾個能充分反映原有變量信息的新變量 ，從而在不丟掉主要信息的前提下避開了變量間共線性的問題 ，便于結(jié)果做進一步的分析[3]。這種方法可以嘗試著于各地各種道地藥材，以控制道地藥材的質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[S].中國醫(yī)藥科技出版社， 2005：20，122.

[2] 王龍星， 肖紅斌， 梁鑫淼，等.一種評價中藥色譜指紋譜相似性的新方法：向量夾角法[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 2002 ， 37 (9) ：713-717.

[3] 譚小燕，羅喬奇，馬鄭紅，等. 不同產(chǎn)地麥冬1H-NMR模式識別研究[J]. 中草藥，2009，40(5)：792-797.