胃泌素對大鼠胃黏膜的影響

陶琴琴 周麗雅 鄧 凱 李 淵 林三仁 楊燕琳 黃 琛 陳 櫟

(北京大學第三醫(yī)院消化科,北京 100191)

在胃腸道激素參與消化系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展的研究中,胃泌素(gastrin,GAS)尤為引人注目,隨著對腫瘤分子生物學的不斷研究,在胃癌[1]、大腸癌[2]、胰腺癌[3]以及小細胞肺癌[4]等腫瘤組織中均觀察到有胃泌素基因的表達,在癌組織和癌旁組織中胃泌素受體陽性表達率也明顯高于正常組織,提示胃泌素可作為腫瘤臨床診斷與預后的一項參考指標。Michael等[5]指出胃癌患者血清胃泌素水平明顯升高,腫瘤經(jīng)手術(shù)切除后,血清胃泌素明顯下降,術(shù)后當腫瘤復發(fā)時胃泌素水平又再次升高,提示胃泌素的升高可能是胃癌癌前病變的一種征象,可作為鑒別胃良惡性疾病的一個較好的生物學標志物。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染與消化道腫瘤形成的關(guān)系正受到人們的重視,Robertson等[6]認為可能與其誘導的胃泌素水平升高有關(guān)。因此,對胃泌素的研究,有助于臨床上對患者采取合理的治療方式。本研究通過單獨的胃泌素刺激W istar大鼠,探索胃泌素對大鼠胃黏膜的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

胃泌素(注射用)購于 Sigma公司,為白色粉末,使用前用二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為 0.2 μg/μl的溶液。小鼠抗大鼠多克隆胃泌素抗體購于中山金橋公司,兔抗大鼠多克隆組胺酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)抗體購于 America Research Product公司,這兩種抗體在使用前分別用抗體稀釋液配成所需濃度。二抗鼠/兔通用型抗體和 DAB(二氨基聯(lián)苯胺或聯(lián)苯二胺,3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride)顯色液均購于Dako公司。

1.2 實驗動物及分組

健康雄性 Wistar大鼠 60只,4周齡,體重 70 g左右,北京維通利華實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(京)2006-0008],飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部的實驗動物中心。所有動物隨機分為 2組,空白對照組 22只,不加任何處理因素,自由飲用純凈水;胃泌素組 38只,連續(xù)每天每只皮下注射胃泌素 300 μg/kg,共 30天,自由飲用純凈水。

1.3 動物標本取材和染色

實驗第 12周開始取材,每隔 4周取材一次,共觀察 56周?？瞻讓φ战M每次處死 2只(第 54周和第 56周由于動物只數(shù)有限各處死了 1只),胃泌素組每次處死 3只。禁食 24小時,2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,取出大鼠胃,沿胃大彎切開,用生理鹽水把胃表面充分清洗干凈,然后肉眼觀察胃黏膜大體形態(tài)變化,每只動物在胃體和胃竇分別取材2塊,隨后將組織固定于 10%中性福爾馬林溶液中,經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度 5μm),進行蘇木精 -伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,觀察胃黏膜的組織病理學變化,并且在 10倍光學顯微鏡下,每張切片隨機取 10個視野,測量胃泌酸區(qū)黏膜層的厚度,取平均值(mm)。

1.4 大鼠胃組織免疫組織化學染色

上述石蠟切片,分別做胃泌素抗體(1∶100)和HDC抗體(1∶400)的免疫組化染色,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)代替一抗作為陰性對照,用公司提供的陽性反應組織作為陽性對照。具體步驟參照操作說明書進行。結(jié)果判定標準：凡胞漿中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為蛋白陽性細胞。每張切片隨機觀察 10個高倍視野進行細胞計數(shù)分析,將上述免疫組化結(jié)果用 Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件進行圖像分析,細胞計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠胃組織 HE染色情況

見圖1、2?？瞻讓φ战M動物胃未見明顯異常,且胃黏膜層厚度處于相對平穩(wěn)的狀態(tài)。胃泌素組動物胃黏膜層出現(xiàn)腺體的單純增生,厚度增加。

2.2 胃泌素抗體和 HDC抗體在兩組胃組織中表達的比較見圖3～5?？瞻讓φ战M胃組織中胃泌素抗體和 HDC抗體的表達始終處于相對平穩(wěn)的狀態(tài)。隨著實驗時間的延長,胃泌素組胃組織中胃泌素抗體的表達雖然逐漸下降,但其表達一直處于相對較高水平狀態(tài),而 HDC抗體的表達呈逐漸上升,然后趨于平穩(wěn)。

3 討論

胃泌素由分布于胃竇和十二指腸近端的 G細胞分泌,與腸嗜鉻樣細胞(enterochromaffin-like cell,ECL)上特異受體即膽囊收縮素 B(cholecystokinin-B,CCK-B)結(jié)合后,作用于組胺酸脫羧酶,刺激 ECL細胞合成和釋放組胺,介導對壁細胞胃酸分泌的調(diào)節(jié)[7]。同時胃泌素亦作為一種營養(yǎng)性胃腸道激素,不僅刺激正常胃腸道黏膜組織的生長,還能通過與其受體介導的細胞內(nèi)信號傳導途徑刺激 ECL細胞過度增殖,刺激胃癌、大腸癌等腫瘤細胞的生長[8]。

本研究結(jié)果顯示：胃泌素組動物出現(xiàn)了腺體的單純增生,黏膜層增厚,黏膜快速增厚期為前 24周。盡管本實驗胃泌素只連續(xù)使用了 30天,但是增厚的胃黏膜在停止了外源性胃泌素的刺激后,在觀察的56周內(nèi)增厚的胃黏膜也沒有恢復到正常。對高胃泌素血癥的Zollinger-Ellison綜合征患者進行結(jié)腸鏡檢查和細胞增殖動力學的研究[9],結(jié)果表明長期高胃泌素血癥可以促進腸道黏膜過度增生而發(fā)生癌變。在癌旁組織中胃泌素陽性表達率明顯高于正常組織[10]。癌旁組織中雖然沒有明顯的組織形態(tài)學改變,但是胃泌素的表達已經(jīng)增高,提示此處組織可能已經(jīng)處于癌前病變狀態(tài),在需要實行手術(shù)切除腫瘤治療時,在切除范圍允許的條件下,其遠端的切緣應盡可能地遠離癌變組織[11]。Kawase等[12]在雄性棉鼠中單獨使用 H2受體拮抗劑 loxtidine(即拉伏替丁),造成棉鼠的高胃泌素血癥,6個月后 4/5只棉鼠泌酸黏膜出現(xiàn)不規(guī)則增厚和胃的重量增加,發(fā)生了胃癌。但是本實驗沒有誘導出胃癌,可能與胃泌素只使用了 30天,使用的時間過短有一定關(guān)系,動物的飼養(yǎng)方式、給藥方式和藥物劑量等均可能導致出現(xiàn)不同的誘癌效果,因此單獨使用胃泌素能否引起胃癌發(fā)生的研究還有待于進一步深入的探討。

圖1 兩組大鼠胃體 HE染色圖(×100)A.空白對照組;B.胃泌素組?？梢娢该谒亟M腺體單純增生,胃黏膜層增厚

圖2 兩組大鼠胃泌酸區(qū)黏膜層的厚度

為了進一步探討胃黏膜層增厚的可能機制,本研究采用免疫組化方法對兩組胃組織標本進行分析處理。胃泌素抗體作為 G細胞的標記物,HDC是ECL細胞合成組胺所必需的酶,可以作為 ECL細胞的標記物。與空白對照組相比,胃泌素組動物胃泌素抗體和 HDC抗體的表達均升高,提示胃泌素水平升高后,與 ECL細胞上特異性 CCK-B受體結(jié)合,刺激 ECL細胞增殖及生長分化,這與既往的研究結(jié)論相一致。胃泌素升高后,刺激 ECL細胞的過度增殖是胃泌素促進胃黏膜增厚的可能機制之一。長期使用質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs)的患者,高胃泌素血癥導致胃黏膜 ECL細胞增生的現(xiàn)象也比較常見,甚至可以出現(xiàn) ECL細胞微小結(jié)節(jié)樣增生,連續(xù)的組織學觀察顯示,高胃泌素血癥刺激 ECL細胞發(fā)生增生以后,即使停用PPIs,不但高胃泌素血癥難以恢復,ECL細胞增生也不會恢復,這兩者可以互相促進,互為因果[13]。合并 Hp感染的服藥患者,由于疊加的影響,隨著高胃泌素的加重,胃黏膜ECL細胞增生的現(xiàn)象更為明顯[14]。

圖3 胃泌素抗體和 HDC抗體免疫組化圖(×400),兩種抗體陽性反應物主要位于胞漿,呈棕黃色顆粒,經(jīng)蘇木素復染后胞核呈藍色。A.空白對照組胃竇胃泌素抗體;B.胃泌素組胃竇胃泌素抗體;C.空白對照組胃體 HDC抗體;D.胃泌素組胃體HDC抗體。胃泌素組大鼠不同胃組織中胃泌素抗體和 HDC抗體的表達均高于空白對照組

目前臨床上常用的 H2受體拮抗劑和 PPIs類藥物均可能在抑酸的同時導致胃泌素水平升高,胃食管反流病發(fā)生率的升高也會使這兩類藥物的使用有所增加。而且中國又是一個 Hp感染高發(fā)的國家,Hp的感染又會進一步使胃泌素升高。胃泌素水平升高后,可以引起 ECL細胞的過度增殖,黏膜層增厚,且有潛在的誘發(fā)胃腸道腫瘤的作用。因此,在使用這些藥物之前是否需要根除 Hp,而且在使用這些藥物期間是否需要進行隨訪及藥物的使用期限等,均是需要我們解決的問題。分子生物學技術(shù)的發(fā)展,將會加快對胃泌素及其受體研究的深入,將有助于揭示消化道腫瘤的發(fā)病機制,為臨床設(shè)計受體激動劑和拮抗劑奠定基礎(chǔ)。胃泌素及其受體拮抗劑的研究將為消化道腫瘤的內(nèi)分泌治療開辟新的途徑。

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