馬國(guó)英,楊小榮,趙 欣,趙晉楓,秦華平,史瑞紅,張 策

研究發(fā)現(xiàn)糖代謝障礙不僅存在于糖尿病而且也存在于阿爾茨海默病(AD)[1],進(jìn)一步的研究證實(shí)糖尿病和AD有共同的病理改變,如糖尿病患者AD的發(fā)生率明顯高于同齡的非糖尿病者,制作糖尿病的工具藥鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射和腦室注射均可引起神經(jīng)損傷及AD樣的病理變化,腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有Aβ的沉積和Tau蛋白的過度磷酸化等AD樣的病理特征。而AD大多數(shù)伴有糖代謝的紊亂。腦室注射STZ可以導(dǎo)致正常大鼠出現(xiàn)AD樣的病理變化,如線粒體功能異常、神經(jīng)元死亡、學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知障礙等。在離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中可以引起細(xì)胞活力下降,活細(xì)胞數(shù)目減少,乳酸脫氫酶(LDH)釋放增加。其機(jī)制可能是削弱或破壞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),破壞胰島素受體自身磷酸化和內(nèi)在酪氨酸激酶活性,增加磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性[2],導(dǎo)致胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,引起腦葡萄糖代謝紊亂和能量生成受阻。

吡格列酮(Pioglitazone)屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑,主要通過結(jié)合和活化過氧化物酶體增殖物激活的受體γ(PPARs)而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素作用的敏感性,在臨床上主要用于2型糖尿病的治療。已證實(shí)吡格列酮對(duì)側(cè)腦室注射STZ的大鼠的空間記憶力和海馬的突觸結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元的受損有保護(hù)作用[3]。而同樣屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑的羅格列酮對(duì)散發(fā)性老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有明顯的改善作用[4]。噻唑烷二酮類胰島素增敏劑可能對(duì)AD有預(yù)防治療作用[5]。吡格列酮對(duì)由STZ引起的神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)STZ對(duì)離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞也具有損傷作用,那么吡格列酮對(duì)離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞STZ損傷是否也有保護(hù)作用?

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 新生1 d～3 d Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理中心)。STZ、Calcein-AM 購于 Sigma公司,吡格列酮由浙江華義醫(yī)藥有限公司惠贈(zèng),DMEM購于Gibico,胎牛血清(FBS)購于杭州四季青公司。將STZ溶于D-Hanks溶液中,配成10 mmol/L的母液,由于STZ溶液的半衰期在生理pH值條件下為19 min[6],需要溶解后立即使用。吡格列酮用二甲亞砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀釋配置成0.1 mmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L的母液,常溫保存,培養(yǎng)液中DMSO終濃度不得高于0.1%。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時(shí),將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞隨即分組:由于中樞的胰島素主要來自兩方面,由胰島產(chǎn)生即外周血漿中的胰島素透過血腦屏障進(jìn)入中樞和神經(jīng)組織自身合成的胰島素[6],為了更好模擬在體情況,在實(shí)驗(yàn)中都加入胰島素15μU/mL。對(duì)照組以全配液培養(yǎng);STZ組,在全配液培養(yǎng);吡格列酮組,在全配液中加入終濃度(0.01 μ mol/L,0.1 μ mol/L,1 μ mol/L)的吡格列酮,24 h后除了對(duì)照組以外其他組都加STZ(100μ mol/L)。共同作用36 h后觀察細(xì)胞的活力以及活細(xì)胞數(shù)目(LDH,CCK-8和Calcein-AM染色)。

1.3 原代皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 取新生1 d～3 d的Wistar大鼠,將大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液,按細(xì)胞濃度為1×106接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿或96孔板中,放在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后加入阿糖胞苷(10μ mol/L)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。

1.4 細(xì)胞活力分析 在96孔板中培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)提前24 h加入吡格列酮,再經(jīng)STZ誘導(dǎo)36 h后,還新的全配液,每空加入10 μL的 CCK-8,37℃避光培養(yǎng) 2 h,到酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm吸光度值。

1.5 LDH釋放的檢測(cè) 將皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中,經(jīng)提前24 h加入吡格列酮,再加入STZ誘導(dǎo)36 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行LDH活性的檢測(cè)。

1.6 Calcein-AM染色 將皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在有玻片的培養(yǎng)皿中,經(jīng)提前24 h加入吡格列酮,再加入STZ誘導(dǎo)36 h后,用PBS液沖洗3次,加入終濃度為10μ mol/L的Calcein-AM,37℃避光培養(yǎng) 20 min,再經(jīng) PBS避光洗滌 3次后,在激光共聚焦顯微鏡(Olympus,FV-1000)下觀察細(xì)胞,激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm拍片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 測(cè)定結(jié)果由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,進(jìn)行單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8的測(cè)定 STZ組與對(duì)照組比較,細(xì)胞活力明顯下降,STZ組由對(duì)照組的100%降至63.93%(P＜0.01);提前24 h加入吡格列酮(0.01 μ mol/L)細(xì)胞活力升高12.83%(P＜0.01,n=4);吡格列酮(0.1 μ mol/L)細(xì)胞活力升高 6.06%(P＜0.05);吡格列酮不能抑制STZ引起的細(xì)胞活力下降。詳見圖1。

圖1 吡格列酮對(duì)STZ誘導(dǎo)皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(CCK-8檢測(cè))

2.2 Calcein-AM染色 STZ處理后,活細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,伴有突起數(shù)目明顯減少;提前加入吡格列酮明顯抑制STZ引起的活細(xì)胞數(shù)目減少,突起數(shù)目明顯增加;吡格列酮抑制STZ引起的活細(xì)胞數(shù)目減少,突起數(shù)目增加;吡格列酮不能抑制STZ引起的活細(xì)胞數(shù)目減少。

2.3 LDH釋放的檢測(cè) STZ組與對(duì)照組比較,LDH的含量明顯增加,釋放量增加42.31%(P＜0.01);吡格列酮(0.01μ mol/L)可以降低有STZ引起的細(xì)胞損傷,使 LDH的釋放減少14.46%(P＜0.01);吡格列酮(0.1 μ mol/L)可以降低STZ引起的細(xì)胞損傷,使LDH的釋放減少10.04%(P＜0.05);吡格列酮(1 μ mol/L)不能抑制STZ引起細(xì)胞 LDH的釋放。詳見圖2。

圖2 吡格列酮對(duì)STZ誘導(dǎo)皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(LDH釋放水平檢測(cè))

3 討 論

中樞胰島素主要由胰島產(chǎn)生即外周血漿中的胰島素透過血腦屏障進(jìn)入中樞,然而研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織自身也可以合成胰島素并參與代謝調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用[7]。胰島素受體在腦內(nèi)皮層、海馬等與認(rèn)知功能密切相關(guān)的區(qū)域分布較密集。胰島素通過它與細(xì)胞膜上的胰島素受體(IR)相結(jié)合,通過胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程激發(fā)細(xì)胞內(nèi)特定的生理生化反應(yīng)[8]。

研究證實(shí),糖代謝紊亂和AD發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系,尤其在晚發(fā)性AD中,糖代謝紊亂可能是重要的始動(dòng)因子。多種證據(jù)顯示腦內(nèi)糖代謝障礙可以引起認(rèn)知功能受損,而認(rèn)知功能障礙為主的AD常伴有腦內(nèi)糖代謝障礙。由于糖代謝紊亂(糖尿病)與AD間有著非常密切的聯(lián)系,有可能存在同樣的發(fā)病因素和病理過程,因而有專家提出AD可能是一種大腦特異的神經(jīng)內(nèi)分泌疾病或者稱“3型糖尿病”[9]。

吡格列酮是一種作用于PPAR-γ的胰島素增敏劑,PPAR-γ被激活后提高胰島素敏感性,通過胰島素受體和受體后途徑,加強(qiáng)胰島素信號(hào)系統(tǒng)作用,增加靶細(xì)胞中胰島素受體的表達(dá);增加胰島素受體底物(IRS)的表達(dá),促其磷酸化;增加靶細(xì)胞中PI-3K調(diào)節(jié)亞基的表達(dá),促進(jìn)胰島素功能實(shí)現(xiàn)。吡格列酮也可能通過增加胰島素受體酪氨酸激酶活性,起到保護(hù)作用。吡格列酮對(duì)側(cè)腦室注射STZ大鼠空間記憶力和海馬突觸結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元的受損有保護(hù)作用[1]。而同樣屬于噻唑烷二酮類胰島素增敏劑的羅格列酮對(duì)散發(fā)性老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有明顯的改善作用[2]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的方法證實(shí)一定濃度的吡格列酮(0.01 μ mol/L和 0.1 μ mol/L)可拮抗STZ對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用,包括細(xì)胞活力的逐漸增加,LDH的釋放逐漸增少,以及活細(xì)胞數(shù)目的逐漸增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為吡格列酮的神經(jīng)保護(hù)作用提供了新的證據(jù),即除已經(jīng)證實(shí)的吡格列酮對(duì)側(cè)腦室注射STZ引起的大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷有保護(hù)作用以外,在離體情況下,吡格列酮同樣可以起到保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)所觀察到的低濃度吡格列酮(0.01 μ mol/L和0.1 μ mol/L)可以發(fā)揮保護(hù)作用,而較高濃度吡格列酮(1 μ mol/L)不能抑制發(fā)揮保護(hù)作用,其詳細(xì)機(jī)制不明,有待進(jìn)一步研究。

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