齊登斌,鄭輯英,李光來,薛國芳

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)是臨床醫(yī)學(xué)急癥之一,可導(dǎo)致急性或持續(xù)性的認知及行為改變,尤其易致海馬、大腦皮質(zhì)等邊緣神經(jīng)元的損傷。細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的自主性、程序性死亡過程,是SE后神經(jīng)元死亡的重要形式。大量研究表明,X-染色體連鎖凋亡蛋白抑制劑(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)參與了多種腦損傷的凋亡調(diào)控機制,使Caspase-3活性下降,神經(jīng)元凋亡減少,腦損傷減輕[1]。然而對于作用于Caspase-3發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)的XIAP在SE中的病理生理機制研究甚少。丙酮酸乙酯是近年來研究較多的新型腦保護劑[2],但丙酮酸乙酯對SE后的神經(jīng)元損傷是否也具有保護作用尚未見報道。本實驗旨在觀察SE后大鼠神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因XIAP、Caspase-3的表達情況,并探討丙酮酸乙酯對SE導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元損傷的影響及其可能機制,為丙酮酸乙酯應(yīng)用于臨床防治SE提供動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重190 g～230 g;氯化鋰、匹魯卡品、丙酮酸乙酯均購自美國Sigma公司;XIAP兔抗鼠多克隆抗體購自北京博奧森生物科技有限公司;Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、T UNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒、DAB試劑均購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 雄性Wistar大鼠54只,隨機分為對照組(N組)6只、模型組(M 組)和丙酮酸乙酯組(EP組)各24只,后兩組按時間點分為4個亞組(6 h,12 h,24 h,48 h)。

1.2.2 動物模型建立 各組均采用灌胃法處理,EP組造模前15 min腹腔注射丙酮酸乙酯50 mg/kg,N組和M組給予等容積生理鹽水。15 min后M組、EP組腹腔注射氯化鋰按體重127 mg/kg,20 h后經(jīng)腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30 mg/kg。N組腹腔注射等量生理鹽水。觀察大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作的時間,SE達1 h時,給予地西泮10 mg/kg腹腔注射終止癲癇發(fā)作。參照 Racine評價標(biāo)準。0級:無任何發(fā)作跡象;Ⅰ級:凝視,頭面部輕微顫動;Ⅱ級:點頭或濕狗樣抖動;Ⅲ級:前肢局限性驚厥;Ⅳ級:具有后肢站立的全身強直性驚厥;Ⅴ級:具有站立伴摔倒的全身強直-陣攣性發(fā)作。

1.2.3 標(biāo)本處理 M組和EP組大鼠分別于SE后相應(yīng)時間點處死,N組同SE后6 h組處死。用25%烏拉坦4 ml/kg深麻醉后,立即斷頭取腦,置入4%的多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后,在視交叉海馬區(qū)連續(xù)切片,片厚5 μ m。

1.2.4 TUNEL染色 按試劑盒(POD)提供的方法進行嚴格操作,細胞核染成棕黃色顆粒者即為陽性細胞,即凋亡細胞。

1.2.5 XIAP、Caspase-3蛋白免疫組化檢測 常規(guī)SABC法行免疫組化檢測,DAB顯色。每張切片取 5個(×400倍)視野,測定每個視野的陽性細胞數(shù),取其平均值。胞漿或核膜染色呈棕黃色為蛋白陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件,兩組間的比較采用t檢驗,多組間的比較采用方差分析,檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察 N組無癲癇發(fā)作。M組大鼠注射匹魯卡品15 min～30 min后均出現(xiàn)節(jié)律性點頭、咀嚼、流涎等動作,隨后出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)前肢陣攣,此后出現(xiàn)前肢陣攣伴站立,進一步發(fā)展到全身強直陣攣發(fā)作伴站立、摔倒,反復(fù)發(fā)作,均達到Ⅳ級～Ⅴ級發(fā)作,呈癲癇持續(xù)狀態(tài)。EP組大鼠也均達到SE,但癇性發(fā)作程度較M組輕,多在Ⅲ級～Ⅳ級,且潛伏期較長。

2.2 HE染色結(jié)果 N組神經(jīng)元整齊排列緊密,細胞核呈圓形或橢圓形,胞漿透明,染色質(zhì)均勻分布,核仁清晰。M組出現(xiàn)嗜酸性神經(jīng)元,細胞排列紊亂,胞體收縮,胞漿紅染、胞核固縮胞。EP組也出現(xiàn)嗜酸性神經(jīng)元,但排列尚可整齊,形態(tài)尚屬正常。

2.3 細胞凋亡檢測 N組僅見少量TUNEL陽性細胞表達。M組SE后6 h可見TUNEL陽性細胞表達,且隨時間點延長而增加,24 h時達高峰,48 h時減少。EP組與M組凋亡陽性細胞數(shù)的變化相似,但相應(yīng)時間點TUNEL陽性細胞數(shù)均顯著少于M 組(除6 h外,P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠海馬 TUNEL陽性細胞數(shù)比較(±s)

表1 各組大鼠海馬 TUNEL陽性細胞數(shù)比較(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h N 組 3.36±0.75 M 組 15.57±1.411) 30.50±2.121) 42.46±1.351)28.44±2.241)EP組 14.45±1.692) 19.62±1.302) 31.50±1.412)20.50±1.412)與N組相比,1)P＜0.05;與M組相比,2)P＜0.05

2.4 XIAP及Caspase-3免疫組化結(jié)果 XIAP、Caspase-3在 N組有微量基礎(chǔ)表達。SE后6 h時M 組XIAP、Caspase-3開始增強,12 h時XIAP達高峰,Caspase-3顯著增強;24 h時XIAP開始減弱,Caspase-3達高峰;48 h時兩者均減弱。EP組與M組比較,各個時間點XIAP和Caspase-3表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(除6 h外,P＜0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組大鼠海馬XIAP陽性細胞數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠海馬XIAP陽性細胞數(shù)比較(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h N 組 13.63±1.87 M 組 27.16±2.021) 41.44±2.641)35.54±2.911) 24.59±1.401)EP組 30.47±1.292) 53.09±2.372)42.52±1.322) 35.56±2.222)與N組相比,1)P＜0.05;與M組相比,2)P＜0.05

表3 各組大鼠海馬Caspase-3陽性細胞數(shù)比較(±s)

表3 各組大鼠海馬Caspase-3陽性細胞數(shù)比較(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h N 組 2.50±1.26 M 組 12.14±1.941) 20.63±1.441)34.57±1.511) 25.57±1.251)EP組 11.43±2.332) 14.55±1.462)23.63±2.772) 17.57±2.292)與N組相比,1)P＜0.05;與M組相比,2)P＜0.05

3 討 論

在大腦癲癇持續(xù)狀態(tài)損傷過程中伴有大量神經(jīng)元凋亡,從而加重了神經(jīng)元的損傷,這主要與細胞內(nèi)鈣超載及氧自由基產(chǎn)生有關(guān)。Caspase蛋白酶家族是執(zhí)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡過程的主要酶類,在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Caspase-3是Caspase家族最重要的蛋白酶,也是凋亡發(fā)生的標(biāo)志性酶。在正常細胞內(nèi)Caspase以無活性的蛋白酶原形式存在,凋亡信號刺激靶細胞時通過Fas/FasL系統(tǒng)和粒酶B/穿孔素系統(tǒng)等途徑以級聯(lián)反應(yīng)的形式被激活,活化的效應(yīng)性Caspase-3是各種凋亡通路的共同中介,能直接或間接酶解一系列細胞存活所必需的蛋白,促進細胞凋亡的發(fā)生。因此,一旦Caspase-3啟動便宣告細胞必定死亡。

凋亡抑制蛋白(IAPs)是迄今作用最強的內(nèi)源性Caspase的抑制劑,IAP家族中XIAP是結(jié)構(gòu)最典型、功能最全面、作用最強的,也是近年來與凋亡相關(guān)的研究熱點[3]。XIAP具有特征性結(jié)構(gòu)即桿狀病毒重復(fù)序列結(jié)構(gòu)(Baculoviral IAP repeat,BIR)及羧基端具有泛素連接酶E3活性的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(Ring finger domain,RING)。XIAP可通過其 BIR2抑制有活性的Caspase-3和Caspase-7,通過BIR3抑制有活性的Caspase-9,同時其具有的RING鋅指結(jié)構(gòu)可介導(dǎo)具有E3活性的XIAP本身和其靶分子的泛素化降解等多種途徑來發(fā)揮抗凋亡作用[4]。研究證實,氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)大鼠 SE后觀察到XIAPmRNA、Smac等表達現(xiàn)象,表明XIAP確實參與了SE后神經(jīng)元損傷的調(diào)控過程[5]。本實驗研究結(jié)果顯示,N組僅有XIAP、Caspase-3基礎(chǔ)量的表達;M組XIAP于SE后6h升高,12h達高峰,48 h減少,而Caspase-3于SE后6 h升高,24 h達高峰,與TUNEL陽性細胞的表達基本一致,進一步證實了XIAP可抑制神經(jīng)元凋亡;EP組各個時間點Caspase-3、TUNEL陽性細胞數(shù)較M組減少(除6 h,P＜0.05),而 XIAP陽性細胞數(shù)增加(除6 h外均P＜0.05),表明丙酮酸乙酯能夠通過上調(diào)XIAP、下調(diào)Caspase-3,從而發(fā)揮抗凋亡作用。

EP作為一種新型的腦保護劑越來越受到人們的關(guān)注。EP能抑制大鼠體內(nèi)的氧自由基的氧化作用,是一種過氧化氫清除劑,具有防止自由基損傷的作用;EP可調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)的釋放如 HMGBl、TNF-α及 IL-6等發(fā)揮抗炎癥介質(zhì)作用[6];對心臟、肝臟、小腸等多種器官缺血再灌注損傷(I/R)、內(nèi)毒素損傷、休克等病理狀況下EP均具有保護作用[7,8]。本研究顯示在大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中,采用丙酮酸乙酯預(yù)處理可減輕癲癇發(fā)作的級別和減少神經(jīng)元的凋亡,其可能機制是通過上調(diào)SE時大鼠腦組織內(nèi)的XIAP的表達及抑制Caspase-3的生成,阻斷凋亡信號傳導(dǎo)通路及凋亡執(zhí)行途徑發(fā)揮抗凋亡作用。丙酮酸乙酯對SE后大腦的保護機制是多途徑、多位點。

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