HPLC法測(cè)定蓮須中木犀草素的含量

李彥博，孫 靜

蓮須為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥雄蕊。味甘、澀，性平，歸心、腎經(jīng)，具有固腎澀精之功效。主要成分為木犀草素、槲皮素、異槲皮苷、山柰素等黃酮類化合物［1］?！吨袊?guó)藥典》［2］僅收載顯微鑒別，無(wú)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。本文首次采用HPLC法建立蓮須中木犀草素的含量測(cè)定方法，為控制蓮須藥材的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Waters二極管陣列檢測(cè)器(PDA 2996)，Waters Empower色譜工作站，UV-2401PC紫外分光光度計(jì)(日本島津)，sartorius電子天平。木犀草素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):111520-200504);甲醇為色譜純;水為純凈水;其余試劑均為分析純。蓮須樣品經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為睡蓮科植物蓮的干燥雄蕊。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex-C18(4.6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45);檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm;PDA色譜峰光譜采集范圍:300～400 nm;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL;理論塔板數(shù)按木犀草素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取木犀草素對(duì)照品適量，用甲醇溶解，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在200～400 nm之間掃描，木犀草素在350 nm處有最大吸收，且峰形良好，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。

2.3 供試品溶液色譜峰純度檢查 由于中藥材無(wú)法制備陰性對(duì)照溶液，故選用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品溶液色譜峰純度進(jìn)行檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照品溶液在木犀草素保留時(shí)間處的光譜圖完全一致，表明供試品溶液在木犀草素保留時(shí)間處無(wú)其他干擾雜質(zhì)。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取木犀草素對(duì)照品(五氧化二磷干燥器中減壓干燥48 h)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100mL，作為木犀草素對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為0.102 mg/mL)。分別精密量取木犀草素對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、2、4、8、10mL，用甲醇溶解并定容至10mL，作為5個(gè)濃度的木犀草素對(duì)照品溶液。分別精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以木犀草素進(jìn)樣量C為橫坐標(biāo)、吸收峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程:A=3744608 C-34106(r=0.9997)。表明木犀草素在 0.204μg～ 2.040μg之間與吸收峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一木犀草素對(duì)照品溶液(濃度為0.0408 mg/mL)，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定，吸收峰面積分別為3054041、3033706、3053315、3046547、3020652，平均為3041652，RSD=0.47%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、6 h 后測(cè)定，吸收峰面積分別為1829629、1825177、1818354、1812158、1806-626，平均為1818389，RSD=0.51%。表明供試品溶液在制備后6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果分別為 0.0419%、0.0422%、0.0415%、0.0421%、0.0417%，平均為0.0419%，RSD=0.68%。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量(0.0423%)的樣品6份，分別精密加入一定量木犀草素對(duì)照品，按樣品測(cè)定方法處理，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。木犀草素的平均加樣回收率為99.44%，RSD=0.82%。表明測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠。

表1 木犀草素含量測(cè)定加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取樣品粉末2 g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

圖1 木犀草素含量測(cè)定高效液相色譜圖

表2 蓮須中木犀草素含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，筆者從提取方法、提取溶媒、提取時(shí)間3個(gè)方面對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流提取的效率高于超聲提取，以甲醇為溶媒提取效果優(yōu)于乙醇;分別以1 h、2 h、3 h為提取時(shí)間的研究結(jié)果顯示，2 h木犀草素溶出即達(dá)到平衡，2 h以后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，測(cè)得木犀草素含量不再增加，故確定供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取2 h。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的蓮須樣品中木犀草素含量有一定差異。其中浙江杭州產(chǎn)的蓮須木犀草素含量最高，達(dá)0.0844%;河北保定產(chǎn)的蓮須木犀草素含量最低，為0.0404%。前者高出后者一倍多。

3.3 HPLC法測(cè)定蓮須中木犀草素的含量，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，加樣回收率高，可以用于蓮須的質(zhì)量控制，填補(bǔ)《中國(guó)藥典》蓮須項(xiàng)下無(wú)含量測(cè)定的空白。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典.下冊(cè)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:2501.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:257.