RP-HPLC法測定參芪肝康膠囊中水飛薊賓的含量

王 婷，于 雪，李 飛

參芪肝康膠囊是由茵陳、黨參、水飛薊、五味子、當(dāng)歸、黃芪6味藥材與刺五加浸膏組成的復(fù)方中藥制劑，具有祛濕清熱，調(diào)和肝脾之功效。臨床適用于濕熱內(nèi)蘊與肝脾不和所致的急、慢性肝炎［1］。其中水飛薊已成為目前世界性的保肝植物，以其為主藥的制劑已廣泛用于治療急慢性肝炎及肝硬變等。水飛薊素為保肝的主要活性成分，具有抗氧化、降血脂、清熱解毒和疏肝利膽的作用，其中活性最強(qiáng)的是水飛薊賓［2］。因此，制劑中水飛薊賓的含量測定對該制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。參芪肝康膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］中含量測定項下，采用高效液相色譜法測定茵陳中綠原酸的含量。為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，全面有效地控制參芪肝康膠囊的質(zhì)量，本文建立了測定參芪肝康膠囊中水飛薊賓含量的HPLC方法。

1 儀器與試劑

LC-10ATvp-UV高效液相色譜儀，ANASTAR色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，BS110S電子分析天平(Sartorius)。參芪肝康膠囊(編號 01、02、03)，規(guī)格:10 g/袋(自制)。水飛薊賓對照品(中國藥品生物制品檢定所)。甲醇為色譜純，其他試劑為分析純;水為重蒸水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱Diamonsil C18(200mm × 4.6mm，5μm，迪瑪公司);流動相:甲醇-0.5%冰醋酸(48∶52，v/v);流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:287 nm;理論板數(shù)按水飛薊賓計算不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取水飛薊賓對照品適量，置100mL棕色量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.2 mg/mL的水飛薊賓對照品儲備液。精密量取水飛薊賓儲備液0.4mL，置10mL棕色量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為48μg/mL的水飛薊賓對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取七味藥粉末，按制劑工藝制備［1］，研細(xì)，精密稱定0.1 g，加水10mL，用乙醚萃取3次，每次10mL，合并乙醚萃取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至2mL，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 按處方制備不含水飛薊藥材的樣品，照“2.3”項下方法制成陰性溶液。

2.3 測定法 分別精密吸取“2.2”項下的3種溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測量峰面積，按外標(biāo)法計算，即得。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 和 2.0mL，分別置 10mL棕色量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以峰面積(Y)對其濃度(X)進(jìn)行線性回歸，水飛薊賓的回歸方程和線性范圍:Y=9.062 ×103X- 1.352×104，r=0.9997(12.0～240μg/mL)

圖1 色譜圖

2.5 精密度實驗 取“2.2.2”項下的同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣，測定6次，每次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，水飛薊賓的RSD為0.6%。結(jié)果表明，本方法精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 測定峰面積值，計算含量。結(jié)果表明，樣品室溫放置24 h穩(wěn)定，水飛薊賓含量的RSD為1.3%。

2.7 重復(fù)性實驗 稱取同一批號的參芪肝康膠囊(編號:01)6份，按“2.2.2”項下方法操作，制備供試品溶液。依次進(jìn)樣，以色譜峰面積按外標(biāo)法計算。水飛薊賓平均含量為1.143 mg/g，RSD為1.9%。表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收率實驗 稱取已知含量的同一批參芪肝康膠囊(編號:01)9份，精密稱定，每份0.05 g，分別精密量取混合對照品儲備液0.025、0.050、0.075mL，照“2.2.2”項下方法操作，所得供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算。水飛薊賓的方法回收率為97.0%，RSD為1.9%，結(jié)果見表1。

2.9 供試品的含量測定 取3批樣品，照“2.2.2”項下方法操作，制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算參芪肝康膠囊中水飛薊賓含量。結(jié)果見表2。

表1 參芪肝康膠囊中水飛薊賓的回收率

表2 參芪肝康膠囊中水飛薊賓的含量(n=5)

3 討論

3.1 有關(guān)水飛薊賓的含量測定方法有紫外分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法，本文采用反相高效液相色譜法測定了水飛薊含量，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)［3］。

3.2 實驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用高效液相色譜法測定水飛薊賓對照品出現(xiàn)2個色譜峰，水飛薊賓對照品由2個異構(gòu)體構(gòu)成，且很難得到單一成分。故用水飛薊賓對照品2個異構(gòu)體所得的峰面積之和來定量，以控制參芪肝康膠囊的質(zhì)量。

3.3 水飛薊賓是木脂素黃酮類化合物，易溶于有機(jī)溶劑，樣品直接加甲醇超聲提取，HPLC法色譜圖中有較多雜質(zhì)峰，改用乙醚、乙酸乙酯、飽和正丁醇萃取后，殘渣加甲醇溶解，比較后發(fā)現(xiàn)，用乙醚萃取水飛薊賓色譜峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離。

［1］國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品中藥標(biāo)準(zhǔn).內(nèi)科肝膽分冊［S］.2009:10-11.

［2］劉新波.水飛薊［J］.黑龍江科技信息，2010，9:49-49.

［3］馮希勇，朱小虎，邢海燕.高效液相色譜法測定水飛薊的含量［J］.甘肅中醫(yī)，2009，22(4):73-74.