王明霞，孫長(zhǎng)崗，唐世鋒

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261042;2.濰坊市中醫(yī)院腫瘤科，山東濰坊261041)

乳腺癌是成年女性多發(fā)的惡性腫瘤，有很高的發(fā)病率和死亡率，骨骼是乳腺癌轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)的部位，且癌性骨轉(zhuǎn)移對(duì)患者的生活質(zhì)量和身體機(jī)能影響較大［1］。因此針對(duì)癌性骨痛治療的研究受到廣泛關(guān)注。蛙魚(yú)降鈣素的主要作用是抑制破骨細(xì)胞的活性，防止骨鈣丟失，減少骨吸收而增加骨質(zhì)量，其生物活性比人類(lèi)降鈣素高20～40倍，其也具有一定的抗炎和中樞止痛作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究其對(duì)癌性骨轉(zhuǎn)移所致疼痛的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;鮭魚(yú)降鈣素，購(gòu)自慶安醫(yī)藥公司;von－Frey全套毛針BME－403，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供;Walker 256細(xì)胞，購(gòu)自北京百和科技發(fā)展有限責(zé)任公司;唑來(lái)膦酸，購(gòu)自美國(guó)LKT公司。

1.2 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的制備

1.2.1 細(xì)胞體外無(wú)菌環(huán)境培養(yǎng)方法 取出Walker 256細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴箱中快速解凍。擦干凍存管上的水漬，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒管口，超凈工作臺(tái)上旋開(kāi)管口，用吸管吸出細(xì)胞懸液，移入離心管中，再補(bǔ)加適量含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，吹打使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)用培養(yǎng)基漂洗1次，加入適量培養(yǎng)基后接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞 Wistar大鼠體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)方法 選擇Wistar大鼠乳腺癌肉瘤細(xì)胞株Walker 256細(xì)胞，于同系Wistar大鼠腹腔內(nèi)接種Walker 256細(xì)胞0.5 mL(2×107mL－1)，飼養(yǎng)1周，大鼠腹腔內(nèi)有大量腹水，取微黃色瘤性腹水3 mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水7 mL混勻，1 500 r/min離心5 min，取沉淀，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水10 mL漂洗后，1 200 r/min再次離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液稀釋到2×107mL－1備用。

1.2.3 大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型建立 參照姚明等［2］的方法建立大鼠脛骨癌痛模型:質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，以大鼠腳趾對(duì)有齒鑷鉗夾無(wú)反應(yīng)為麻醉滿(mǎn)意指標(biāo)，消毒并切開(kāi)左側(cè)脛骨下1/3皮膚，分離肌肉，暴露脛骨骨面。取5號(hào)鋼針頭垂直于骨面進(jìn)針，待有骨突破感后拔出針頭，用注射器取細(xì)胞懸液5 μL注入骨髓腔內(nèi)，用無(wú)菌骨蠟封孔，逐層用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水沖洗并縫合。接種腫瘤細(xì)胞手術(shù)后將動(dòng)物放置于籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)動(dòng)物(即空白組)注入等量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 接種腫瘤細(xì)胞手術(shù)后第8天始給藥。鮭魚(yú)降鈣素組:骨癌痛模型制備成功后，隔日皮下注射鮭魚(yú)降鈣素7.5 ng/d;鮭魚(yú)降鈣素+唑來(lái)膦酸組:骨癌痛模型制備成功后，隔日皮下注射鮭魚(yú)降鈣素 7.5 ng/d+ 緩慢皮下注射唑來(lái)膦酸 0.1 mg/kg，2次/周;唑來(lái)膦酸組:骨癌痛模型制備成功后，隔日緩慢皮下注射唑來(lái)膦酸0.1 mg/kg，2次/周，其余時(shí)間給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水;對(duì)照組:骨癌痛模型制備成功后，隔日皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水;空白組:隔日皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水。

1.4 機(jī)械痛敏的測(cè)定 接種腫瘤細(xì)胞手術(shù)后的第8、13、18、23、28 天，用電子 von Frey測(cè)痛儀刺激大鼠足底柔軟部位，接觸時(shí)間2～3 s，出現(xiàn)縮足或舔足反應(yīng)時(shí)的讀數(shù)為機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，閾值上下各刺激3次，間隔5 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

與空白組相比，大鼠于骨癌痛模型制備后的第8天MWT明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，各治療組大鼠于骨癌痛模型制備后的第18、23天MWT提高，其中鮭魚(yú)降鈣素+唑來(lái)膦酸組MWT升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);鮭魚(yú)降鈣素組、唑來(lái)膦酸組僅表現(xiàn)出MWT升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。于骨癌痛模型制備后的第28天，各治療組MWT較對(duì)照組提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示鮭魚(yú)降鈣素、唑來(lái)膦酸對(duì)癌性骨痛大鼠均具有提高M(jìn)WT，降低機(jī)械痛敏的作用。見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)大鼠MWT的比較

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移至骨骼系統(tǒng)將誘發(fā)產(chǎn)生持續(xù)性骨癌痛，且隨著時(shí)間推移日益加劇，可造成患者的身體機(jī)能和生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。有研究表明，高達(dá)80%的乳腺癌患者會(huì)在不同階段出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移病灶，而由乳腺癌骨轉(zhuǎn)移所引起的骨相關(guān)事件(高鈣血癥、病理性骨折、骨痛、神經(jīng)壓迫癥狀等)是導(dǎo)致晚期患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降及致死的重要原因之一［3－5］。目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療方法主要有放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療，但這些方案都有一定的局限性。因此，發(fā)現(xiàn)新的藥物治療骨癌痛至關(guān)重要。而1999年Schwei等［6］首次報(bào)道了小鼠骨癌痛的模型，推動(dòng)了癌痛的基礎(chǔ)研究，為抗癌痛藥物的研制及發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。

本實(shí)驗(yàn)在骨癌痛模型制備成功后，分別給予鮭魚(yú)降鈣素、唑來(lái)膦酸或兩藥聯(lián)合，通過(guò)測(cè)定MWT觀察鮭魚(yú)降鈣素用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移性癌痛的可行性及效果，結(jié)果表明鮭魚(yú)降鈣素和唑來(lái)膦酸聯(lián)合應(yīng)用效果最佳。

綜上所述，鮭魚(yú)降鈣素能減輕骨癌痛，鮭魚(yú)降鈣素和唑來(lái)膦酸聯(lián)合使用效果更加明顯。這為臨床用藥提供了理論依據(jù)，也為骨癌痛的治療提供了新思路。

［1］Ghilardi JR，R?hrich H，Lindsay TH，et al.Selective blockade of the capsaicin receptor TRPV1 attenuates bone cancer pain［J］.J Neurosci，2005，25(12):3126 －3131.

［2］姚明，楊建平，王麗娜，等.腹水傳代與體外培養(yǎng)Walker 256癌細(xì)胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(13):880－884.

［3］Martin TJ，Moseley JM.Mechanisms in the skeletal complications of breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2000，7(4):271 －284.

［4］Weiss L.Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy［J］.Clin Exp Metastasis，1992，10(3):191－199.

［5］Yoneda T，Williams PJ，Hiraga T，et al.A bone－seeking clone exhibits different biological properties from the MDA－MB－231 parental human breast cancer cells and a brain－seeking clone in vivo and in vitro［J］.J Bone Miner Res，2001，16(8):1486 －1495.

［6］Schwei MJ，Honore P，Rogers SD，et al.Neurochemical and cellular reorganization of the spinal cord in a murine model of bone cancer pain［J］.J Neurosci，1999，19(24):10886 －10897.