擬南芥莖表皮蠟缺失突變體cera蠟成分分析

連金番，常 青，孫建麗，石 磊，王 倩

（西北農(nóng)林科技大學生命學院，陜西 楊凌 712100）

角質(zhì)層是覆蓋陸生植物表層組織的一層由角質(zhì)和表皮蠟組成的脂質(zhì)保護層。角質(zhì)層的重要組成成分角質(zhì)是由氧化的C16和C18脂肪酸構成網(wǎng)狀的油脂聚酯[1]。嵌入和覆蓋網(wǎng)狀角質(zhì)層的表皮蠟是一類超長鏈脂肪族疏水化合物[2]，嵌入角質(zhì)層的非晶體狀的表皮蠟稱作內(nèi)表皮蠟，而覆蓋在角質(zhì)層表面并形成晶體的表皮蠟稱為外表皮蠟[3]。

表皮蠟在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，如防止由非氣孔蒸發(fā)造成的水分散失，抗寒[4]，抵抗紫外線輻射[5]，去除植物表皮表面外部水分，以降低溶于外部水分中的灰塵、花粉粒和其他有害物質(zhì)對植物表皮造成的傷害[6-7]。在抵御細菌、真菌病原體和昆蟲的入侵及植物-昆蟲相互作用方面表皮蠟也發(fā)揮重要作用[8-9]。另外表皮蠟還能提供一種花粉粒-柱頭相互作用信號使植物在適宜時期進行授粉[10]。

氣相色譜-質(zhì)譜分析結果顯示，植物表皮蠟有100多種成分，主要包括長鏈和超長鏈脂肪族化合物、環(huán)狀化合物以及甾醇類化合物，這些化合物均由20～34個碳原子超長鏈脂肪酸衍生而來[3]。某些植物表皮蠟質(zhì)組成成分還包括酚、固醇、環(huán)萜以及胡蘿卜素類化合物[3,11]。表皮蠟的化學組成成分和數(shù)量在同一株植物上的不同部位及不同的生長發(fā)育階段也存在差異[12]。模式植物擬南芥的表皮蠟的化學組成成分主要是超長鏈脂肪酸及其衍生物，如醇、酯、烷烴、醛、酮等[3,11]。

植物超長鏈脂肪酸的合成是將質(zhì)體中合成的C16/C18的長鏈脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進一步延伸。該延長過程由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂肪酸延長酶復合體催化，此復合體由四個酶組成，依次催化四步反應：①脂酰-CoA和丙二酰-CoA由3-酮脂酰-CoA縮合酶催化聚合反應生成3-酮脂酰-CoA；②3-酮脂酰-CoA被3-酮脂酰-CoA還原酶還原生成3-羥脂酰-CoA；③3-羥脂酰-CoA由3-羥脂酰-CoA脫水酶催化脫水生成烯脂酰-CoA；④烯脂酰-CoA經(jīng)烯脂酰-CoA還原酶還原成比第一步脂酰-CoA多兩個碳原子的脂酰-CoA[13]。

生成的超長鏈脂肪酸經(jīng)過一系列特異生物途徑衍生為蠟的不同組分。已有文獻報道，擬南芥中表皮蠟中脂肪族成分合成有兩條途徑：脫羧途徑和?；€原途徑[14]。脫羧途徑從脂酰-CoA還原酶催化超長鏈脂肪酸前體生成醛開始，經(jīng)由醛脫羧酶催化生成奇數(shù)碳原子的烷烴[15]，烷烴再經(jīng)過一系列的氧化生成次級醇和酮；?；€原途徑始由對超長鏈脂肪酸的還原生成初級醇[16]，部分初級醇進一步和游離脂肪酸酯化生成蠟脂[17]。

角質(zhì)蠟能影響植株莖表皮色澤，所以一旦蠟合成有關的基因發(fā)生突變導致蠟含量減少，肉眼即可識別到植株莖表皮色澤變化。在大麥和擬南芥中蠟缺失突變體稱為eceriferum（cer），而在玉米和甘藍型油菜被稱為gl。目前與擬南芥蠟合成有關的多個基因已被報 道 ， 如 CER1、 CER2、 CER3、 CER4、 CER5、CER6和CER10等，已從擬南芥基因組中克隆到cer1、cer2和cer3突變體蠟缺失表型顯著，但克隆的基因在蠟合成及運輸中的具體作用尚不清楚[18-21]。CER4編碼的酶催化?；€原途經(jīng)的初級醇生成[22]。CER5編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白負責表皮蠟的運輸[23]。CER6和CER10分別編碼植物超長鏈脂肪酸合成酶復合體的3-酮脂酰-CoA縮合酶和烯脂酰-CoA還原酶[24-25]。在大麥中分別克隆到與CER1、CER2基因相似性高的GL1和GL2基因。但是，目前對擬南芥蠟合成基因的研究還不十分完善。我們利用EMS化學誘變劑處理野生型擬南芥得到莖表皮蠟缺失突變體cera。該突變體莖色澤淺綠，果莢和植株較野生型短小。本研究對該突變體進行掃描電鏡觀察植株莖表皮蠟晶體形態(tài)，遺傳分析，莖表皮角質(zhì)蠟化學組成成分和含量分析，為以后該基因的克隆及研究其在角質(zhì)蠟合成過程發(fā)揮的角色奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）：生態(tài)型Columbia（Col-0）；擬南芥突變體cera：由本實驗室用EMS誘變得到的莖色突變株系。

1.1.2 數(shù)據(jù)庫

本試驗所需數(shù)據(jù)信息來源于:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,http://www.arabidop sis.org/（TAIR）和http://www.genevestigator.ethz.ch/。

1.2 方法

1.2.1 EMS處理野生型擬南芥

取2 g野生型種子（Col-0）于100 mL無菌水中，4℃過夜。加400 mL無菌水，磁力攪拌器攪拌，100 r·min-1離心1 h。加入EMS使其終濃度為0.3%（V/V），室溫，100 r·min-1離心16 h。4 ℃靜置3 d，種植材料。

1.2.2 材料種植

擬南芥在0.1%的瓊脂糖中4℃春化2～4 d后培養(yǎng)在黑土∶蛭石∶沙子（1∶1∶1）的混合土中。培養(yǎng)時在其上層罩一層塑料膜以保持濕度，當擬南芥萌發(fā)出4～5片子葉后去掉塑料膜。16 h光照處理，8 h黑暗[26]，濕度保持在60%～70%，溫度控制在22～25℃，光照強度2 800 lx。

1.2.3 突變體的背景純化與遺傳分析

以擬南芥野生型Col-0為父本，突變體為母本進行回交得到F1代，F(xiàn)1代自交得到F2代。種植并觀察F2代表型，統(tǒng)計F2代中莖淺綠色突變體和正常植株莖色的比例。

1.2.4 電子掃描顯微鏡觀察

取植株頂端2.5 cm莖包于錫箔紙中，-180℃真空放置5 min。樣品置于電子掃描顯微鏡（Hitachi S4700），2.5 kV加速電壓，觀察植株莖表皮蠟晶體。

1.2.5 莖表皮蠟提取及組分分析

將莖浸泡在含5 μL 1 μg·μL-1C24∶0烷烴的三氯甲烷中30 s，于液氮中干燥濃縮。濃縮后的樣品轉(zhuǎn)入到氣相色譜分析管中，加10 μL N，O-三氟乙酰胺和10 μL吡啶后，70℃加熱1 h，液氮干燥，加100 μL三氯甲烷，進行氣相色譜氫焰離子化檢測（GC-FID）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析。

2 結果與分析

2.1 突變體cera的表型與遺傳分析

cera突變體是經(jīng)化學誘變劑EMS誘導野生型擬南芥（Col-0）篩選得到的莖色變化植株。該突變體莖表現(xiàn)為淺綠色，這種表型與蠟缺失cer系列突變體表型相似，因此命名為cera（見圖1）。另外，突變體果莢長度也較野生型短并且低育，我們將突變體和cer6置于潮濕環(huán)境中培養(yǎng)，cer6果莢長度恢復到野生型水平，而cera卻未恢復，這說明cera低育并不像cer1和cer6一樣，它們的低育是由于花粉粒水化導致的[14,18,27]。由花粉粒水化導致的低育植株，在潮濕環(huán)境中培養(yǎng)，生育能力可恢復到野生型水平。

為了探討該突變是否由于單基因隱性突變造成，將篩選到的cera突變體與野生型擬南芥（Col-0）雜交得到F1代，F(xiàn)1所有植株均表現(xiàn)野生型表型。F1自交后得到F2代，種植96株F2，其中73株表現(xiàn)野生型表型，23株表現(xiàn)cera表型，比例為3.17∶1（x2=0.0577，P＞0.7），證實該突變?yōu)閱位螂[性突變。

圖1 野生型(Col-0)和突變體ceraFig.1 Wild type and cera

2.2 掃描電子顯微鏡觀察cera突變體莖表皮蠟

為揭示cera突變體莖色澤變化是否與其莖表皮蠟含量變化有關，用掃描電鏡觀察cera突變體和野生型擬南芥的莖，結果顯示野生型莖表面布滿晶體狀表皮蠟，這些晶體有柱狀、錐狀、棒狀、傘狀等，然而cera突變體莖表面卻沒有觀察到晶體狀蠟（見圖2）。cera突變體莖表皮蠟缺失的表型與cer系列莖表皮蠟缺失表型相似，說明CERA基因可能與擬南芥莖表皮蠟的合成和運輸有關。

圖2 野生型和突變體cera莖表皮蠟晶體分布Fig.2 Stem surface morphology of wild type(left)and cera(right)by cryo-SEM

2.3 氣相色譜氫焰離子化檢測和氣相色譜-質(zhì)譜分析cera突變體莖表皮蠟成分及含量

為進一步揭示cera突變體莖表皮蠟的變化，采用氣相色譜氫焰離子化檢測（GC-FID）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）測量野生型和5株cera突變體（cera1～cera5）莖表皮總蠟的組分和含量（見圖3），結果顯示野生型擬南芥表皮幾乎檢測不到C24和C26脂肪酸，C30脂肪酸含量為0.39 μg·cm-2（1 cm2莖表面含有0.39 μg C30脂肪酸）；cera突變體C24脂肪酸和C26脂肪酸平均含量分別為0.09和0.06 μg·cm-2，所有cera突變體均檢測不到C30脂肪酸。然而在野生型和cera突變體中，都沒有檢測到C28脂肪酸。表皮蠟中脂肪族成分合成的兩種途徑中各組分含量的結果顯示，?；€原途徑中C24初級醇含量cera突變體比野生型增加約140%，但C26，C28和C30初級醇含量明顯減少，分別減少70%，94%和93%；在脫羧途徑中，cera突變體除C24和C26醛較野生型略增加外，大于C26的其他組分比野生型均有明顯的減少（見圖3）。但這些數(shù)據(jù)并不包含參與合成酯反應的超長鏈脂肪酸以及初級醇。

圖3 野生型和突變體cera莖表皮蠟化學組分與含量分析Fig.3 Stem wax composition of wild type and cera mutant

另外，cera突變體莖表皮中檢測到屬于固醇類的β-香樹脂醇，但野生型沒有檢測到，該物質(zhì)是合成固醇類化合物前體，但其與蠟合成的相關關系還沒有報道。值得一提的是，在5株cera突變體超長鏈脂肪酸中，部分脫羧途徑代謝中間產(chǎn)物含量卻不一致，因此把這5株cera突變體分成A組（cera1，cera2和cera4）和B組（cera3和cera5），測量結果顯示B組含有比A組較多的C29的烷烴（＜94%），次級醇（＜81%）和酮（＜95%）。很難解釋造成這種差異的原因是因為遺傳因素造成的這種差異還是由于其他因素，例如收集樣品并不是從同一植株采集的樣品，這些不同植株可能存在生長狀況的差異。為此，我們重復將cera突變體與野生型回交得到F1，F(xiàn)1自交得到F2，測量F2莖表皮蠟脂肪族組成成分，結果與A組相似。

從擬南芥表皮蠟脂肪族組成成分碳鏈長度來分析，并將酯含有的超長鏈脂肪酸及醇計算在內(nèi)（見圖4）。由圖4可以看出，cera突變體中C24含量是野生型的222%，而C26和C28卻分別為33%和26%，由此得出CERA基因作用于延伸C24以上的超長鏈脂肪酸。

圖4 野生型和突變體cera莖表皮超長鏈脂肪族C24、C26和C28組分含量分析Fig.4 Sum amount of C24,C26and C28in wild type and cera stem wax components

3 討論

擬南芥中表皮蠟中脂肪族成分合成有兩條途徑：?；€原途徑和脫羧途徑，作為蠟合成底物的超長鏈脂肪酸及其衍生物并不是均勻的分配到這兩個途徑中。Millar和Kunst等認為，在蠟合成過程中，大部分C28和少部分C26、C30超長鏈脂肪及其衍生物經(jīng)由酰基還原途徑合成蠟；而大部分C30和小部分C28，C32超長鏈脂肪及其衍生物經(jīng)由脫羧途徑合成蠟[13]。然而我們的測量結果卻發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥初級醇含量C28（1.76）＞＞C26（0.97）＞C30（0.66），醛含量C30（0.57）＞＞C28（0.15）＞C26=C24=0，由此我們認為大部分C28、C26、C24和小部分C30超長鏈脂肪酸及其衍生物通過酰基還原途徑參與蠟合成，而大部分C30和少部分C24、C26、C28超長鏈脂肪酸及其衍生物通過脫羧途徑參與蠟合成（見圖5）。

圖5 擬南芥莖表皮蠟合成途徑Fig.5 Proposed metabolic pathways for wax biosynthesis in Arabidopsis stems

cera突變體莖色澤淺綠，遺傳分析表明為單基因隱性突變，電鏡掃描顯示突變體莖表皮蠟晶體缺失，氣相色譜分析數(shù)據(jù)表明突變體莖表皮蠟減少是由C24以上超長鏈脂肪酸供應不足導致，這些性狀與cut1和cer6相仿。cer6中C26以上蠟組分減少，然而cut1中C24以上蠟組分就已經(jīng)減少，cut1突變體是將35S:antisense:CER6轉(zhuǎn)入擬南芥野生型中得來。cut1突變體中CER6及其同源基因的表達都可能有不同程度的抑制[27]。cut1卻和cera莖角質(zhì)蠟化學組分相似，即都是C24以上蠟組分明顯減少。雖然cera和cer6、cut1表型相似，但是cera所表現(xiàn)的由果莢短小導致的低育在潮濕環(huán)境中卻不能像cer6和cut1一樣得到恢復，這說明cera和cer6的功能可能存在差異。

野生型和cera莖表皮蠟化學組分和含量分析表明CERA基因在延長24個碳原子以上的超長鏈脂肪酸發(fā)揮作用。鑒于上述比較，我們對CERA基因的功能做以下分析。CERA可能是編碼超長鏈脂肪酸合成酶復合體的3-酮脂酰-CoA縮合酶的CER6的等位基因；或者是不同于CER6的延伸C24超長鏈脂肪酸的合成酶；或者編碼一種與CER6形成復合體的蛋白。CERA也可能在DNA、RNA或者蛋白水平調(diào)控延長C24以上超長鏈脂肪酸的合成酶方面發(fā)揮作用，在DNA水平上，CERA可能編碼一種影響DNA甲基化或者組蛋白修飾的酶，以此阻礙編碼延長C24以上超長鏈脂肪酸的合成酶的轉(zhuǎn)錄；在RNA水平，CERA可能是一種轉(zhuǎn)錄因子影響像CER6這樣的延伸過程中的合成酶的轉(zhuǎn)錄，也可能是一種類似于CER7的外切體亞基，能夠降解編碼合成酶的mRNAs[28]，或者通過micro RNA來降解與超長鏈脂肪酸合成有關的mRNAs；在蛋白水平，CERA可能涉及合成酶的翻譯后修飾，例如泛素化，SUMO化，磷酸化和棕櫚化等。除了上面我們討論的CERA在C24以上超長鏈脂肪酸的延伸可能的影響外，它也可能具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性參與超長鏈脂肪酸的延伸?？傊?，本文章的數(shù)據(jù)表明CERA基因在擬南芥莖表皮延長24個碳原子以上的超長鏈脂肪酸過程中發(fā)揮重要作用，這值得我們克隆該基因并作深入研究。

4 結論

本試驗發(fā)現(xiàn)莖色澤淺綠的cera突變體莖表皮蠟減少是由C24以上超長鏈脂肪酸供應不足導致，表明供應擬南芥莖表皮蠟合成的C24以上超長鏈脂肪酸是由特異的酶復合體催化生成。此外對野生型擬南芥莖表皮蠟各成分詳細分析表明大部分C28、C26、C24和小部分C30超長鏈脂肪酸及其衍生物通過?；€原途徑參與蠟合成，而大部分C30和少部分C24、C26、C28超長鏈脂肪酸及其衍生物通過脫羧途徑參與蠟合成。

[1]Kurdyukov S,Faust A,Nawrath C,et al.The epidermis-specific extracellular BODYGUARD controls cuticle development and morphogenesis in Arabidopsis[J].Plant Cell,2006,18:321-339.

[2]Walton T J.Waxes.cutin and suberin[M]//Harwood J L,Boyer J.Methods in plant biochemistry,Virginia:Academic Press,1990:106-158.

[3]Kunst L,Samuels A L.Biosynthesis and secretion of plant cuticular wax[J].Progr Lipid Res,2003,42:51-80.

[4]王多佳,蒼晶,牟永潮,等.植物抗寒基因研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(10):134-138.

[5]Reicosky D A,Hanover J W.Physiological effects of surface waxes.I.Light reflectance for glaucous and nonglaucous Picea pungens[J].Plant Physiol,1978,62:101-104.

[6]Kerstiens G.Signalling across the divide:A wider perspective of cuticular structure-function relationships[J].Trends in Plant Science,1996(1):125-129.

[7]Barthlott W,Neinhuis C.Purity of the sacred lotus,or escape from contamination in biological surfaces[J].Planta,1997,202:1-8.

[8]Jenks M A,Joly R J,Peters P J,et al.Chemically induced cuticle mutation affecting epidermal conductance to water vapor and disease susceptibility in Sorghum bicolor(L.)Moench[J].Plant Physiol,1994,105:1239-1245.

[9]Eigenbrode S D,Espelie K E.Effects of plant epicuticular lipids on insect herbivores[J].Annu Rev Entomol,1995,40:171-172.

[10]Preuss D,Lemieux B,Yen G,et al.A conditional sterile mutation eliminates surface components from Arabidopsis pollen and disrupts cell signaling during fertilization[J].Genes Dev,1993(7):974-985.

[11]Greene P R,Ban C D.Total internal reflection Raman spectroscopy of barley leaf epicuticular waxes in vivo[J].Colloids Surfaces B,2005,45:174-180.

[12]Wettestein-Knowles P V.Biosynthesis and genetics of waxes[M]//Waxes:chemistry,molecular biology and functions.Hamilton R J.Dundee:The Oily Press.1995:131-174.

[13]Fehling E,Mukherjee K D.Acyl-CoA elongase from a higher plant(Lunaria annua):Metabolic intermediates of very-longchain acyl-CoA products and substrate specificity[J].Biochim Biophys Acta,1991 1082(3):239-246.

[14]Millar A A,Clemens S,Zachgo S,et al.CUT1,an Arabidopsis gene required for cuticular wax biosynthesis and pollen fertility,encodes a very-long-chain fatty acid condensing enzyme[J].Plant Cell,1999(11):825-838.

[15]Cheesbrough T M,Kolattukudy P E.Alkane biosynthesis by decarbonylation of aldehydes catalyzed by a particulate preparation from Pisum sativum[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:6613-6617.

[16]Kolattukudy P E.Enzymatic synthesis of fatty alcohols in Brassica oleracea[J].Arch Biochem Biophys,1971,142:701-709.

[17]von Wettstein-Knowles P M.Genetics and biosynthesis of plant epicuticular waxes[M]//Applequist L,Liljenberg C.Advances in biochemistry and physiology of plant lipids,The Netherlands:Elsevier/North Holland Biomedical Press,1979:1-26.

[18]Aarts M G M,Keijzer C J,Stiekema W J,et al.Molecular characterization of the CER1 gene of Arabidopsis involved in epicuticular wax biosynthesis and pollen fertility[J].Plant Cell,1995(7):2115-2127.

[19]Xia Y,Nikolau B J,Schnable P S.Cloning and characterization of CER2,an Arabidopsis gene that affects cuticular wax accumulation[J].Plant Cell,1996(8):1291-1304.

[20]Negruk V,Yang P,Subramanian M,et al.Molecular cloning and characterization of the CER2 gene of Arabidopsis thaliana[J].Plant Journal,1996(9):137-145.

[21]Hannoufa A,Negruk V,Eisner G,et al.The CER3 gene of Arabidopsis thaliana is expressed in leaves,stems,roots,flowers and apical meristems[J].Plant Journal,1996(10):459-467.

[22]Rowland O,Zheng H,Hepworth S R,et al.CER4 encodes an alcohol-forming fatty acyl-coA reductase involved in cuticular wax production in Arabidopsis[J].Plant Physiol,2006,142(3):866-877.

[23]Pighin J A,Zheng H,Balakshin L J,et al.Plant cuticular lipid export requires an ABC transporter[J].Science,2004,306:702-704.

[24]Hooker T S,Millar A A,Kunst L.Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis[J].Plant Physiol,2002,129(4):1568-1580.

[25]Zheng H,Rowland O,Kunst L.Disruptions of the Arabidopsis enoyl-coA reductase gene reveal an essential role for very-longchain fatty acid synthesis in cell expansion during plant morphogenesis[J].Plant Cell,2005,17:1467-1481.

[26]劉守偉,劉士勇.擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)技術研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2007,38(2):279-281.

[27]Fiebig A,Mayfield J A,Miley N L,et al.Alterations in CER6,a gene identical to CUT1,differentially affect long-chain lipid content on the surface of pollen and stems[J].Plant Cell,2000(12):2001-2008.

[28]Hooker T S,Lam P,Zheng H,et al.A core subunit of the RNA processing/degrading exosome specifically influences cuticular wax biosynthesis in Arabidopsis[J].Plant Cell,2007,19:904-913.