武影 束蓉 劉宏偉

（1.同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周科，上海 200072；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 牙周科，上海 200011）

唾液是人體的一面鏡子，許多疾病都可以在唾液中找到相關(guān)的蛋白分子標(biāo)記物，如舍格倫綜合征、類風(fēng)濕病、高血壓、糖尿病等。盡管利用唾液檢測診斷全身性疾病有較大發(fā)展但應(yīng)用于口腔疾病的研究還很少，而且主要用于口腔癌的早期診斷和預(yù)后判斷[1]。目前已有涉及牙周病的唾液蛋白組學(xué)研究[2-3]。

眾所周知，慢性牙周炎是與全身性疾病密切相關(guān)的多因素疾病，其發(fā)病機制尚不清楚。利用慢性牙周炎患者和健康對照者的非刺激性全唾液（whole unstimulated saliva，WUS），通過蛋白組學(xué)方法，即雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜檢測二者唾液中的差異，并對差異蛋白質(zhì)點進行鑒定，為今后揭示慢性牙周炎的機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

根據(jù)1999年美國牙周病分類國際研討會提出的慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院牙周科就診的患者中隨機選取5例CP患者。同時選取5例健康對照者，牙齦探診出血的位點＜10%，探診深度＜3mm，附著喪失＞2mm的位點不超過1%，X線片顯示無牙槽骨吸收。各組均有3名男性，2名女性；CP組和對照組平均年齡分別為46、42歲。2組共同納入標(biāo)準(zhǔn)：全身無系統(tǒng)性疾病；婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內(nèi)未做過牙周基礎(chǔ)治療；最近3個月未服用過抗生素；全口無齲者；無抽煙者。

1.2 WUS的采集和處理

按照Rhodus改良的方法采集WUS[5]。每人平均采集1.2mL唾液，采集后立即加入蛋白酶抑制劑（Sigma公司，美國，每毫升唾液加入100μL）。將所得樣本在4℃條件下離心，先1 300 g，5min，去除食物殘屑等；然后20 000 g，30min，徹底去除殘余細(xì)胞。最后各取其上清500μL，-80℃保存待用。待收集完所有的樣本后，合并組內(nèi)各樣品，分別放入超濾管離心以進行樣品超濃縮。依照Bradford法，通過測定光密度值大小并對照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的光密度值計算蛋白濃度，從而進行蛋白定量[6]。

1.3 2-DE

取上樣量100μg，等電聚焦為pH3～10非線性膠條（30V 12 h，500V 1 h，1 000V 1 h，8 000V 8 h；Amersham公司，美國），十二烷基硫酸鈉-聚炳烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）為12.5%的膠。經(jīng)銀染顯色的凝膠通過GS-710光密度掃描儀獲取圖像，使用Imagemaster分析軟件（GE healthcare公司，美國）進行分析，統(tǒng)計3次重復(fù)實驗的2-DE圖譜（CP組和對照組各3次），得到合乎統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)差異點。蛋白質(zhì)斑點的量被定義為構(gòu)成這個點所有象素點強度值的總和，當(dāng)一種蛋白質(zhì)在2組樣品之間量變倍數(shù)大于1.5倍時認(rèn)為這個蛋白在二者之間有顯著性差異。

1.4 基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行肽質(zhì)量指紋分析

切取膠上的蛋白差異點并用胰酶酶解20 h，抽提酶解肽段，經(jīng)Zip Tip脫鹽后樣品溶于0.1%三氟乙酸，然后基質(zhì)與樣品1∶1體積混合，取1μL加到不銹鋼樣品靶上，在空氣中放置10min，待溶劑揮發(fā)干后將樣品靶送入儀器。利用Flex Analysis分析軟件將肽質(zhì)量指紋分析（peptide mass fingerprinting，PMF）數(shù)據(jù)和MS-MS數(shù)據(jù)結(jié)合，將結(jié)合數(shù)據(jù)集提交到MASCOT（免費蛋白數(shù)據(jù)庫檢索程序）進行蛋白鑒定。搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，搜索的參數(shù)：肽片段相對分子質(zhì)量最大容許誤差控制在±10-4，肽電荷為+1，酶解片段不完全選擇為1個。根據(jù)蛋白質(zhì)得分與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)的匹配和序列覆蓋情況，其中Mascot得分示意圖：X軸為Mascot得分，Y軸為匹配的個數(shù)，得分超出陰影區(qū)表示得到陽性鑒定（P＜0.05）。

2 結(jié)果

通過ImageMaster軟件對2組樣品2-DE膠上的點進行對比分析，發(fā)現(xiàn)2組之間存在著差異點（組間差異倍數(shù)≥1.5），得到17個差異點（圖1）。

而這些點經(jīng)過以上串聯(lián)質(zhì)譜儀結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索進行鑒定，可明確其中的13個點的蛋白質(zhì)類型，包括一些未命名蛋白和假設(shè)蛋白（表1），其中737、725、692、986為同一種蛋白，716、535為相同蛋白。剩下的蛋白未能從數(shù)據(jù)庫中得到結(jié)果，提示可能為未知蛋白。這些差異蛋白在CP組的唾液中表達均增加，其中包括血清白蛋白（serum albumin）、β-纖維蛋白（βfibrin）、重組N-葉apo型人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2型晶體B鏈（chain B，human serum transferrin，recombinant N-terminal lobe，Apo form，crystal form 2）、免疫球蛋白α-1鏈C區(qū)（Ig alpha-1 chain C region）、 人血清白蛋白GA復(fù)合物（the GA module complexed with human serum albumin，HBA-GA）、Rca-Rhogdi復(fù)合物的B鏈（chain B，crystal structure of a Rca-Rhogdi complexes）、PRO2044、未命名蛋白、理論蛋白。

表1 CP組和對照組間的唾液差異表達蛋白Tab 1 Differentially expressed proteins in saliva between control group and CP group

3 討論

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清白蛋白在CP患者WUS中的表達是上調(diào)的，這與以往的研究報道患者全唾液中白蛋白含量顯著升高的結(jié)論一致[7-8]。因為全唾液中含有10%來源的齦溝液成分，在牙周組織炎癥狀態(tài)下齦溝液流量增大，進入唾液的成分也可能增高，其中包括血液中高豐度的白蛋白，同時這些蛋白也可經(jīng)炎性牙齦組織直接滲出。血清白蛋白在唾液中的升高反映了牙周炎的嚴(yán)重程度和活動性，可作為CP患者唾液中的分子標(biāo)記物。實驗還發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白與對照組相比，CP患者全唾液中的IgA1上調(diào)，原因同上述解釋一樣，IgA1主要來自血液滲出，而且有研究表明糖尿病患者的IgA是升高的[9-10]。在CP組和對照組的差異蛋白比較中發(fā)現(xiàn)HBA-GA復(fù)合物，GA是厭氧性消化鏈球菌屬來源的白蛋白結(jié)合蛋白分子結(jié)構(gòu)上的一個模塊，可以和宿主的血清白蛋白結(jié)合，形成HBA-GA復(fù)合物，有利于細(xì)菌的生長，也可增強細(xì)菌的毒力[11-12]。雖然GA的生物學(xué)功能還不十分清楚，但從其結(jié)構(gòu)上可以解釋細(xì)菌適應(yīng)性這個問題。這也提示牙周致病菌是否也有類似的結(jié)構(gòu)和白蛋白結(jié)合，繼而引起一系列變化導(dǎo)致組織的破壞。既然HBA-GA復(fù)合物關(guān)系著致病微生物和宿主血清白蛋白之間的相互作用，研究二者可能會有助于揭示牙周致病菌的分子機制，以及為開發(fā)藥物以抑制細(xì)菌的生長繁殖開辟一個新的領(lǐng)域。與此同時，上調(diào)的轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖維蛋白都與炎性滲出增加有關(guān)。而Rca-Rhogdi復(fù)合物通過Rhogdi調(diào)節(jié)Rho蛋白，但在炎癥中究竟有什么作用還不甚清楚。

本實驗未發(fā)現(xiàn)在牙周炎患者唾液中表達升高的防御素以及一些基質(zhì)金屬蛋白酶等，這可能由于采用的實驗方法不同以及2-DE技術(shù)自身的缺點所致。對于蛋白質(zhì)表達譜，希望比較2個不同樣品在2-DE膠上存在著特征點強度的不同。但很難得到精確的重復(fù)性。同時特定蛋白質(zhì)的位置通常有微小變化。所以只能選擇重復(fù)性好的點進行鑒定，這樣就會損失一些可能有意義的蛋白。而且，由于樣品中高豐度蛋白的干擾和低豐度蛋白的低溶解度，造成低豐度蛋白很難被檢測到，恰恰這些蛋白是執(zhí)行重要生物功能的蛋白質(zhì)。這需在以后研究中進一步探索。

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