盧 霞,王榮福,張春麗

(1.北京大學 第一醫(yī)院核醫(yī)學科,北京 100034;2.北京航天總醫(yī)院 影像中心,北京 100076)

惡性腫瘤是目前導致患者死亡最主要的疾病之一,在全世界的發(fā)病率仍然呈持續(xù)增長的勢頭。分子功能顯像綜合了分子生物學、合成化學及可視化技術的優(yōu)勢,在腫瘤的基礎研究領域、臨床前研究及臨床研究中有重要的應用價值。示蹤劑的敏感性和特異性是目前腫瘤診斷及治療研究的難點。

腫瘤新生血管生成是維持腫瘤快速生長及遠處轉移不可缺少的重要因素,已經引起越來越多研究者的關注。大多數(shù)研究都致力于發(fā)現(xiàn)能夠示蹤腫瘤新生血管生成的新型腫瘤示蹤劑。放射性核素標記的單克隆抗體示蹤腫瘤新生血管內皮特征分子是腫瘤新生血管示蹤的主要研究方向。與放射性核素標記單克隆抗體相比,核素標記多肽相對分子質量小,能夠更容易進入其作用的靶點[1]。Brow n等[2]利用大腸桿菌肽展示文庫發(fā)現(xiàn)了小分子肽片段精氨酸-精氨酸-亮氨酸(Cys-Gly-Gly-A rg-A rg-Leu-Gly-Gly-Cys,RRL)能夠特異性結合于腫瘤來源的血管內皮細胞,而與正常的血管內皮細胞不結合。已有研究者[3]將氣體微泡(MB)連接于 RRL多肽,通過RRL特異性結合于腫瘤新生血管內皮細胞性質,進行腫瘤新生血管顯像。其研究結果顯示,腫瘤血管來源的內皮細胞中,MB-RRL的結合量是對照組及心肌組織中的3倍多。MB-RRL能夠優(yōu)先結合于腫瘤新生血管內皮細胞,能夠示蹤腫瘤新生血管的形成,有潛在的腫瘤血管靶向治療應用可能性。

本課題組在放射性核素標記RRL方面已經做了一些嘗試性研究[4]。研究結果顯示,修飾小分子肽RRL的原有結構,在其氨基端添加一個酪氨酸,變成包含十個氨基酸的小肽,能夠被放射性核素131I標記,且標記物能選擇性地濃聚于腫瘤組織內。本工作擬在此基礎上進一步評價131I-RRL體外的生物學特性及與腫瘤實質細胞的關系;進行體內黑色素瘤腫瘤模型動物SPECT成像,了解標記物在腫瘤分子成像中的價值。

1 主要實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

RM 905型活度計:中國計量科學研究院提供;ND-1000型分光光度計:美國NanoDrop Technologies公司產品;SPECT顯像儀(GEMRP):美國 GE公司產品;CO2孵箱:美國Thermo Fisher公司產品;細胞培養(yǎng)超凈工作臺:美國Thermo Fisher公司產品;倒置顯微鏡CK 40、FV 1000激光共聚焦顯微鏡:Olympus公司產品。

1.2 主要材料與試劑

氯胺-T:分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司產品;Na131I溶液:原子高科股份有限公司產品;RRL多肽:純度大于99%,北京中科亞光生物技術公司產品。其他試劑均為分析純,購自北京化學試劑公司。

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人肝癌細胞(HepG2)、黑色素瘤細胞(B16)、人主動脈內皮細胞(HAEC):購自南京凱基生物有限公司;胎牛血清:美國Gibco公司。

1.3 荷瘤裸鼠模型制備

BALB/c裸鼠:雄性,4～6周齡,20～22 g,SPF級,北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。每只裸鼠左前肢皮下接種B16細胞(1×107),待腫瘤直徑長至0.8～1.0 cm時進行動物實驗。

2 實驗方法

2.1 多肽RRL的131I標記

采用氯胺-T法進行 RRL的131I標記。于81μL 0.5 mol/L的PB(pH 7.4)中加入 50μg RRL多肽,待多肽完全溶解后加入 10μL(74 MBq)Na131I,然后加入 9μL(0.9 g/L)新鮮配制的氯胺-T,振蕩反應2m in,用45μL(4 g/L)偏重亞硫酸鈉溶液終止反應。

固定其他標記條件不變,分別延長標記時間,改變氯胺-T的濃度及反應總體積,進行標記條件的優(yōu)化,以獲得較高的標記率。

將標記的混合產物用經牛血清白蛋白(Bovine Serum A lbumin,BSA)飽和,0.05mol/L、pH 7.4的PBS平衡3次的Sephadex G25柱純化分離,流動相用0.05 mol/L(pH 7.4)PBS沖洗,洗脫液用高壓滅菌EP管逐管連續(xù)收集(每0.5 m L,共20管)。分光光度計分析每管多肽含量,活度計測量每管放射性活度。收集高峰管(OD280值以及放射性活度值均最高的管),即為標記產物131I-RRL。

采用紙層析法測定標記物的標記率及放化純度。新華1號層析紙為固定相,V(丙酮)∶V(NS)=3∶1為展開劑,采用γ放射免疫計數(shù)器測量各段放射性計數(shù),計算標記率(純化前標記物峰的計數(shù)占各峰總計數(shù)的百分比)和放化純度(純化后標記物峰的計數(shù)占各峰總計數(shù)的百分比)。

2.2 多肽與腫瘤細胞結合實驗

小分子多肽RRL合成過程中,在其羧基端連接綠色熒光素(FITC),形成標記多肽FITCRRL,進行體外結合實驗。培養(yǎng)腫瘤實質細胞和正常組織對照細胞,待細胞生長狀態(tài)良好、處于指數(shù)生長期時,將細胞轉移至6孔板中,使細胞完全貼壁。加入FITC-RRL(2 mg/L)與細胞共同培養(yǎng)24 h,此后用4%的多聚甲醛固定細胞30min,PBS(0.05 mol/L,pH 7.4)輕輕漂洗細胞3次;用0.1%的T ritonX-100對細胞進行透膜,使得染料能夠進入細胞核,用PBS輕輕漂洗細胞3次;用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diam idino-2-pheny lindole,DAPI)染核。在激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC-RRL在腫瘤實質細胞和正常對照細胞中的結合狀況。實驗重復3次。

2.3 SPECT顯像

取3只荷瘤BA LB/c裸鼠,于顯像前3天用含1%的碘化鉀(K I)的飲水,對模型動物的甲狀腺進行封閉。每只荷瘤鼠腹腔注射 444 MBq131I-RRL多肽。分別于注射后6、12和24 h俯臥位進行全身靜態(tài)SPECT顯像。采集條件:能峰365 keV,窗寬 20%,矩陣256×256,放大倍數(shù)2.0,每只裸鼠采集105計數(shù)。

3 結果與討論

3.1 多肽標記結果

采用氯胺-T法標記RRL多肽。最佳標記條件為:多肽用量 50μg,Na131I用量10μL(74 MBq),氯胺-T用量 90μg,反應總體積100μL,振蕩反應 3m in。標記率＞69%。用Sephadex G25柱對標記產物進行分離純化,分光光度計對多肽含量進行分析,結果示于圖1。由圖1a可以看出,第2管放射性計數(shù)達峰值,第5管后放射性計數(shù)已很低。由圖1b可見,吸收峰形成于2、3、4管,峰值位于第2管,此峰與活度計檢測結果的峰吻合,驗證了淋洗出的化合物是131I標記的多肽RRL。優(yōu)化標記條件后,131I標記RRL的標記率達到 69%,與前期實驗標記率60%[4]相比有所提高。放化純度大于95%。131I是最早應用于臨床的核素之一,不僅可以用于顯像診斷,也是應用于放射性核素治療的最重要的核素。在甲狀腺功能亢進癥和甲狀腺腫瘤的治療中有著廣泛的臨床應用及良好的治療效果。131I的物理半衰期為8.04 d,發(fā)射γ和β兩種射線,發(fā)射的γ射線的能量為 365 keV,可用于SPECT顯像;發(fā)射的β射線能量為607 keV,能量較高,能夠用于甲狀腺功能亢進癥及腫瘤的治療;而且131I能夠大量生產,價格低廉,因而有較好的臨床應用價值。

3.2 FITC-RRL體外結合實驗

圖1 131I-RRL純化結果

FITC-RRL與不同種類細胞在37℃孵育24 h后,其熒光顯色結果示于圖2。綠色熒光素通過小分子肽RRL與細胞特異性的結合作用而被細胞攝取,細胞中綠色熒光強度的差異與細胞攝取綠色熒光素的能力及小分子多肽RRL的能力大小呈正相關。由圖2可知,具有腫瘤血管內皮細胞生物學特性的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)及肝癌細胞(HepG2)株中,呈現(xiàn)中等強度的綠色熒光信號,與 RRL呈現(xiàn)中等量的結合;黑色素瘤細胞(B16)株中呈現(xiàn)強綠色熒光信號,與RRL呈現(xiàn)大量的結合;正常血管內皮對照細胞(HAEC)中綠色信號很弱,與RRL結合量很少。

文獻[2]報道,FITC標記的RRL能夠與腫瘤來源的內皮細胞大量結合,氣體微泡連接的RRL與腫瘤血管內皮細胞的結合量是正常心肌細胞的3倍多[3]。本實驗中,盡管RRL在HUVEC細胞中有大量的攝取,但是與惡性黑色素瘤腫瘤實質細胞大量結合 RRL相比,FITCRRL與HUVEC呈中等量的結合,FITC-RRL與正常的血管內皮細胞即人主動脈內皮細胞(HAEC)幾乎不結合,與文獻[3]報道一致。此外,圖2還顯示,結構修飾的RRL(氨基末端連接酪氨酸)除與腫瘤血管內皮細胞結合之外,還能夠與腫瘤實質細胞,包括鼠黑色素瘤細胞(B16)和人肝癌細胞株(HepG2)結合,此現(xiàn)象在國內外均未見報道。RRL能夠特異性地與腫瘤實質細胞及腫瘤來源的血管內皮細胞結合,通過一定的轉運途徑進入細胞后,可能與腫瘤血管內皮細胞及腫瘤實質細胞特異表達的共同受體蛋白質結合。文獻報道,在腫瘤血管內皮細胞及某些腫瘤實質細胞中,均發(fā)現(xiàn)有血管內皮生長因子受體2亞型(Vascular Endothelial Grow th Factor 2,VEGFR-2)特異性高表達[5]。RRL準確的作用機制還有待于進一步深入研究。

圖2 FITC-RRL在腫瘤細胞與正常對照細胞結合熒光顯色結果

3.3 SPECT顯像

在黑色素瘤(B16)腫瘤模型動物注射131IRRL后不同時間點,腫瘤顯像結果示于圖3。由圖3可見,腹腔注射131I-RRL后6 h SPECT顯像,腹腔內可見大量放射性核素濃聚;12 h腫瘤組織可見放射性核素濃聚,24 h腫瘤組織有明顯的放射性顯像劑存留。在前期實驗[4]研究中證實,由尾靜脈給前列腺癌腫瘤模型動物BALB/c裸鼠注射131I-RRL后,隨著時間的延長,除了腫瘤組織以外其余組織放射性活度都明顯下降。腫瘤對131I標記的RRL在6、24 h的攝取明顯高于對131I標記的對照肽GGG的攝取。隨著注射顯像劑后時間的延長,RRL多肽的腫瘤與血液、腫瘤與肌肉的 T/NT比值逐漸升高,至24 h時分別達到1.3和9.1;而對照肽的腫瘤與血液、腫瘤與肌肉的 T/NT比值無升高趨勢。

在本研究小組前期的實驗研究[4]中發(fā)現(xiàn)131I-RRL體內穩(wěn)定性好。生物分布結果顯示,131I-RRL注入體內24 h后,主要滯留在腫瘤組織內,其他組織器官分布較少。本實驗中,腹腔注射顯像劑131I-RRL 444 MBq后,6 h顯像,放射性藥物主要濃聚于腹腔內,腫瘤組織分布較少;12 h顯像,腹腔內放射性聚集明顯降低,腫瘤組織顯像;24 h后顯像,腫瘤組織放射性濃聚灶清晰可見。RRL不但如文獻報道,能夠大量結合于腫瘤來源血管內皮細胞,同時還能夠與多種不同組織來源的腫瘤實質細胞結合,特異性地濃聚于腫瘤組織內,是很有前景的腫瘤小分子多肽顯像劑。

圖3 注射131I-RRL后不同時間點黑色素瘤模型鼠SPECT成像

4 結 論

(1)RRL不僅能夠與腫瘤來源的內皮細胞結合,更重要的是能夠與不同組織來源的腫瘤實質細胞結合。

(2)131I-RRL不但對于前列腺癌有肯定的顯像效果,也能夠特異性濃聚于黑色素瘤模型鼠的腫瘤組織內,對惡性黑色素瘤有肯定的顯像效果。

該實驗結果提示,RRL不僅是一種新型的腫瘤新生血管顯像劑,而且是一種值得繼續(xù)深入研究的廣譜腫瘤分子靶向顯像劑,具有應用于腫瘤放射免疫治療的可能性。

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[3] Weller GE,Wong MK,Modzelewski RA,et al.U ltrasonic imaging o f tumor angiogenesis using cont rast m icrobubb les targeted via the tumor binding peptide arginine-arginine-leucine[J].Cancer Research,2005,65:533-539.

[4] 王榮福,于明明,張春麗,等.131I標記腫瘤血管靶向多肽的實驗研究[J].同位素,2009,22:96-100.

[5] Li S,Peck-Radosavljevic M,Koller E,et al.Characterization of123I-vascu lar endothelial grow th factor-binding sites expressed on human tumour ce lls:possible imp lication for tumour scintigraphy[J].Int JCancer,2001,91:789-796.