鄒 娟，葉蕊芳，鄭 黎，吳 陽(yáng)，張 立，戴 維

(1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.河南天方藥業(yè)股份有限公司，河南 駐馬店 463003)

螺旋霉素(Spiramycin，SPM)是螺旋鏈霉菌(Streptomycesspiramyceticus)發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，主要抗革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、立克次氏體和大型病毒等，對(duì)于感染性疾病治療具有臨床應(yīng)用和推廣價(jià)值[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，螺旋霉素的菌種選育采用過(guò)紫外線(xiàn)(UV)、Co60射線(xiàn)、NTG等誘變方法，均篩選出了高產(chǎn)菌株[2～4]。但是各種誘變方法的比較尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

王筱蘭[5]利用螺旋霉素的前體L-甲硫氨酸和L-纈氨酸類(lèi)似物L(fēng)-乙硫氨酸和L-α-氨基丁酸進(jìn)行定向篩選，達(dá)到高通量篩選效果。螺旋霉素的十六元大環(huán)骨架是由乙酸、丙酸、丁酸等前體縮合而成，丙二酸鈉可以作為它的一個(gè)3C前體結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，乙酰胺可以作為一個(gè)2C前體結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，兩者可以用來(lái)高通量篩選螺旋鏈霉菌。

作者分別采用物理誘變、化學(xué)誘變、復(fù)合誘變處理同一出發(fā)菌株，比較各種處理手段對(duì)螺旋鏈霉菌的誘變效果以及對(duì)其穩(wěn)定性的影響，找出最佳的螺旋鏈霉菌誘變手段，擬為深入研究螺旋鏈霉菌的誘變選育提供一定的理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

螺旋鏈霉菌25-1(出發(fā)菌株)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，生物效價(jià)測(cè)定用)，河南天方藥業(yè)股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

斜面和分離培養(yǎng)基(%)：淀粉4.0，黃豆餅粉2.0，玉米漿0.5，蛋白胨0.5，NaCl 0.2，CaCO30.5，瓊脂粉2.0，pH值6.4，27℃倒置培養(yǎng)12 d，相對(duì)濕度30%～50%。

種子培養(yǎng)基(%)：淀粉 4.0，黃豆餅粉 2.0，玉米漿 0.5，蛋白胨 0.5，NaCl 0.2，CaCO30.5，pH值6.4，27℃、220 r·min-1下旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：淀粉 7.0，黃豆餅粉 1.0，玉米漿 1.5，魚(yú)粉 1.5，MgSO40.1，NH4NO30.6，KH2PO40.1，NaCl 0.8，CaCO30.5，豆油 0.4，pH值6.4，27℃、220 r·min-1下旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)4 d，接種量6%。

生物效價(jià)測(cè)定用培養(yǎng)基(%)：蛋白胨 0.6，酵母粉 0.15，牛肉膏 0.2，葡萄糖 0.3，瓊脂粉上層0.9%、下層1.2%，pH值7.8～8.0，37℃恒溫隔水培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h。

1.3 誘變處理方法

1.3.1 菌懸液的制備

螺旋鏈霉菌25-1從斜面接入(菌量為0.15 cm2)到裝液量為30 mL的250 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，在無(wú)菌條件下吸取8 mL種子液離心(3500 r·min-1，10 min)，棄上清，再用8 mL無(wú)菌生理鹽水清洗菌體1次，離心棄上清，吸取10 mL無(wú)菌生理鹽水稀釋菌體，混勻，制成菌懸液，備用。

1.3.2 紫外誘變處理

取5 mL菌懸液倒入裝有少許玻璃珠的50 mL三角錐形瓶中，振蕩20 min混勻，將菌懸液倒入帶磁力針的平板里，置于紫外燈箱內(nèi)的磁力攪拌器上，分別開(kāi)蓋攪拌照射90 s、120 s、150 s。紫外照射條件：波長(zhǎng)253.7 nm，功率15 W，垂直距離30 cm。為避免光修復(fù)作用，照射過(guò)程不能在日光燈下操作。吸取紫外處理過(guò)的菌液，稀釋?zhuān)鶆蛲坎荚谄桨迳?，以未處理的菌懸液作為?duì)照，于27℃倒置培養(yǎng)12 d接斜面篩選。

1.3.3 Co60射線(xiàn)誘變處理

取裝有3 mL菌懸液的小試管3支，分別用150 000 rad、200 000 rad、250 000 rad強(qiáng)度的Co60射線(xiàn)處理，取出，稀釋?zhuān)鶆蛲坎荚谄桨迳?，以未處理的菌懸液作為?duì)照，于27℃倒置培養(yǎng)12 d接斜面篩選。

1.3.4 EMS誘變處理

吸取5 mL菌懸液接入裝有玻璃珠的50 mL三角錐形瓶中，加入25 μL EMS，于27℃、220 r·min-1下分別振蕩2 h、4 h、6 h，稀釋?zhuān)鶆蛲吭谄桨迳?，以未加入EMS的自然分離組作為對(duì)照，于27℃倒置培養(yǎng)12 d接斜面篩選。

1.3.5 LiCl誘變處理

取5 mL菌懸液用1%LiCl處理3 h、6 h，稀釋?zhuān)鶆蛲坎荚谄桨迳?，以未處理的菌懸液作為?duì)照，于27℃倒置培養(yǎng)12 d接斜面篩選。

1.3.6 LiCl+UV誘變處理

菌懸液先用1%LiCl處理3 h后再紫外照射120 s，稀釋?zhuān)鶆蛲坎荚谄桨迳希晕刺幚淼木鷳乙鹤鳛閷?duì)照，于27℃倒置培養(yǎng)12 d接斜面篩選。

1.3.7 NTG+UV誘變處理

(1)TM緩沖溶液(Tris-馬來(lái)酸緩沖溶液)的配制：稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.121 g、馬來(lái)酸(順丁烯二酸)0.116 g，加20 mL蒸餾水配成0.05 mol·L-1Tris-馬來(lái)酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至9.0，121℃下滅菌5 min。

(2)誘變過(guò)程：稱(chēng)取4 mgNTG于滅菌的50 mL離心管內(nèi)，加入1～2滴甲醇使NTG完全溶解，再加入2 mL TM緩沖溶液，使NTG濃度為2 mg·mL-1。吸取2 mL菌懸液加入到裝有NTG溶液的離心管中，此時(shí)NTG濃度為1 mg·mL-1。將離心管置于裝有棉花或者紗布的三角瓶中，于27℃搖床培養(yǎng)90 min。然后將NTG處理過(guò)的菌懸液以8000 r·min-1離心10 min，棄去上清液(上清液需要用1 mol·L-1NaOH處理)，加入5 mL生理鹽水洗滌，再以8000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，在離心管中加入2 mL生理鹽水，即為處理原液。以未處理的菌懸液和0.1 mL處理原液作為對(duì)照，其余處理原液紫外照射60 s，稀釋?zhuān)科桨澹?7℃倒置培養(yǎng)12 d。

所有接觸過(guò)NTG的用具用1 mol·L-1的NaOH處理數(shù)小時(shí)。

1.4 高通量篩選方法

1.4.1 丙二酸鈉抗性突變菌株的篩選

取處理后的菌懸液稀釋不同倍數(shù)，均勻涂布在含3%、4%、5%、6%、7%、8%丙二酸鈉的分離平板上，周期延長(zhǎng)4 d，于27℃倒置培養(yǎng)16 d。觀(guān)察菌株生長(zhǎng)情況，挑選飽滿(mǎn)單菌落進(jìn)行初篩，并選高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.4.2 乙酰胺抗性突變株的篩選

取處理后的菌懸液稀釋不同倍數(shù)，均勻涂布在含0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%乙酰胺的分離平板上，周期延長(zhǎng)2 d，于27℃倒置培養(yǎng)14 d。觀(guān)察菌株生長(zhǎng)情況，挑選飽滿(mǎn)單菌落進(jìn)行初篩，并選高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

各誘變參數(shù)按下式計(jì)算：

1.5 螺旋霉素效價(jià)測(cè)定[6]

參照2005年版中國(guó)藥典，采用管碟法測(cè)定螺旋霉素的生物效價(jià)。實(shí)驗(yàn)中同一條件的發(fā)酵均為3瓶重復(fù)，效價(jià)為3瓶平均值，誤差小于5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同誘變方法效果及比較

2.1.1 紫外誘變效果

平板上的菌落長(zhǎng)好后，隨機(jī)挑取230株突變菌進(jìn)行初篩，并計(jì)算各參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可知，紫外線(xiàn)處理菌株后致死率、最大提高幅度、正變率均高于未處理菌株，120 s的致死率為80.00%、正變率高達(dá)43.10%、最大提高幅度達(dá)28.21%，而90 s和150 s的最大提高幅度和正變率相對(duì)較低，說(shuō)明紫外線(xiàn)誘變120 s對(duì)螺旋鏈霉菌的效果最好。

表1 紫外誘變不同時(shí)間的結(jié)果

2.1.2 Co60射線(xiàn)誘變效果

平板上的菌落長(zhǎng)好后，挑取230株突變菌進(jìn)行初篩并計(jì)算各參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Co60射線(xiàn)誘變不同劑量的結(jié)果

從表2可知，隨著Co60照射劑量的增加，最大提高幅度和正變率降低，說(shuō)明高劑量處理使菌株向不利于合成螺旋霉素的方向突變，150 000 rad劑量下對(duì)螺旋鏈霉菌的誘變效果最好，最大提高幅度高達(dá)29.03%。

2.1.3 EMS誘變效果

平板上的菌落長(zhǎng)好后，挑取230株突變菌初篩并計(jì)算各參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 EMS誘變不同時(shí)間的結(jié)果

從表3可知，EMS誘變的最大提高幅度和正變率均較高，說(shuō)明EMS誘變對(duì)螺旋鏈霉菌合成螺旋霉素很有利，EMS誘變4 h的效果最好，最大提高幅度達(dá)37.99%。

2.1.4 LiCl誘變效果

平板上的菌落長(zhǎng)好后，挑取200株突變菌初篩并計(jì)算各參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可知，LiCl處理螺旋鏈霉菌后的最大提高幅度和正變率與自然分離效果差不多，說(shuō)明單獨(dú)用LiCl誘變螺旋鏈霉菌的效果不是很明顯。

表4 LiCl誘變不同時(shí)間的結(jié)果

2.1.5 LiCl+UV復(fù)合誘變效果

平板上的菌落長(zhǎng)好后，挑取200株突變菌初篩并計(jì)算各參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 LiCl+UV復(fù)合誘變的結(jié)果

從表5可知，LiCl+UV復(fù)合誘變的最大提高幅度達(dá)31.55%、正變率達(dá)47.60%，比單獨(dú)用UV誘變120 s效果更好，說(shuō)明LiCl+UV復(fù)合誘變對(duì)螺旋鏈霉菌效果較好。

2.1.6 NTG+UV復(fù)合誘變效果

平板上的菌落長(zhǎng)好后，挑取200株突變菌初篩并計(jì)算各參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 NTG+UV復(fù)合誘變的結(jié)果

從表6可知，NTG+UV復(fù)合誘變致死率較高，但最大提高幅度和正變率不高，推測(cè)NTG誘變使螺旋鏈霉菌大量死亡，并不利于其向高產(chǎn)量方向突變。

2.1.7 不同誘變方法比較

選取6種處理方法中各誘變效果最好的劑量，進(jìn)行致死率、正變率和最大提高幅度比較，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 6種誘變方法效果比較/%

由表7可知，除LiCl以外，其余誘變方法的致死率都在80%左右，其中UV、EMS和LiCl+UV的正變率超過(guò)40%，最大提高幅度也高，Co60射線(xiàn)正變率和NTG+UV差不多，但最大提高幅度達(dá)29.03%，故得出UV、Co60射線(xiàn)、EMS、LiCl+UV 4種處理方法對(duì)螺旋鏈霉菌的誘變效果較好。

2.2 不同高通量篩選方法效果

2.2.1 丙二酸鈉抗性突變株的篩選及結(jié)果

丙二酸鈉濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表8。

表8 丙二酸鈉濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

由表8可知，添加丙二酸鈉對(duì)菌落生長(zhǎng)量和形態(tài)影響很大，隨著丙二酸鈉濃度的增加，菌株生長(zhǎng)量減少，菌落長(zhǎng)得更小、顏色更淺，最低致死濃度為7%，故選用6%作為丙二酸鈉定向篩選的濃度。

6%丙二酸鈉法篩選結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 丙二酸鈉法篩選結(jié)果

從表9可知，6%丙二酸鈉篩選出的菌株效價(jià)提高10%以上，且較穩(wěn)定，說(shuō)明丙二酸鈉可作為螺旋鏈霉菌的高通量篩選劑。

2.2.2 乙酰胺抗性突變株的篩選及結(jié)果

乙酰胺濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表10。

表10 乙酰胺濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

從表10可知，添加乙酰胺對(duì)菌株生長(zhǎng)量和形態(tài)影響很大。隨著乙酰胺濃度的增加，菌株生長(zhǎng)量減少，菌2.0%乙酰胺法篩選結(jié)果見(jiàn)表11。

表11 乙酰胺法篩選結(jié)果

從表11可知，乙酰胺對(duì)效價(jià)影響不明顯。原因在于乙酰胺會(huì)顯著減少菌株生長(zhǎng)量，故不適合作為螺旋鏈霉菌的高通量篩選劑。

2.3 各誘變方法對(duì)螺旋鏈霉菌穩(wěn)定性比較

分別采用6種方法誘變和丙二酸鈉法定向篩選菌株，各選3株相對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行3代斜面轉(zhuǎn)接，每一代以3株菌的相對(duì)效價(jià)平均值為基準(zhǔn)，以第1代相對(duì)效價(jià)為100%，考察各誘變方法對(duì)螺旋鏈霉菌的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各誘變方法對(duì)螺旋鏈霉菌的穩(wěn)定性比較

從圖1可知，各誘變方法高產(chǎn)菌株傳代3次后穩(wěn)定性依次為：Co60射線(xiàn)>UV>丙二酸鈉法篩選>LiCl>LiCl+UV>EMS>NTG+UV。這說(shuō)明物理誘變劑對(duì)螺旋鏈霉菌的穩(wěn)定性影響不大，而化學(xué)誘變劑對(duì)螺旋鏈霉菌穩(wěn)定性影響較大。推測(cè)螺旋鏈霉菌本身合成螺旋霉素質(zhì)粒不穩(wěn)定，而EMS和NTG為強(qiáng)誘變劑，可能對(duì)其影響較大。結(jié)合表7各誘變方法致死率、正變率和最大提高幅度的比較，得出UV、Co60射線(xiàn)、LiCl+UV 3種方法對(duì)螺旋鏈霉菌誘變效果最好，而丙二酸鈉用于螺旋鏈霉菌的篩選效果較好。

3 結(jié)論

(1)對(duì)于螺旋鏈霉菌，UV、Co60射線(xiàn)和LiCl+UV 3種誘變方法的誘變效果較好；丙二酸鈉作為螺旋鏈霉菌的高通量篩選劑，能獲得較好的效果，提高了篩選的效率。

(2)化學(xué)誘變劑EMS和NTG對(duì)螺旋鏈霉菌突變效果明顯，但對(duì)菌株的穩(wěn)定性影響較大。

(3)LiCl單獨(dú)使用對(duì)螺旋鏈霉菌的誘變效果不明顯，但與紫外誘變共同使用，有增強(qiáng)作用，可以考慮與其它誘變效果好的方法共同使用。

[1] Webster Carol，Ghazanfar Katayoun，Slack Richard.Subinhibitory and post-antibiotic effects of spiramycin and erythromycin onStaphylococcusaureus[J].Antimicrob Chemother，1988，22(SuppleB)：33-39.

[2] 金志華，宋有禮，黃純農(nóng).螺旋霉素產(chǎn)生菌螺旋霉素鏈霉菌遺傳育種[J].中國(guó)抗生素雜志，1992，17(4)：265-270.

[3] 葉蕊芳，鄭黎.螺旋霉素產(chǎn)生菌抗噬菌體菌株的選育[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1997，23(5)：545-549.

[4] Ford L M，廖富榮，譯.螺旋霉素的高產(chǎn)生二素鏈霉菌突變株的選育及最適生產(chǎn)條件的確定[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，1992，19(6)：404-406.

[5] 王筱蘭.螺旋霉素產(chǎn)生菌菌種選育[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(工科版)，1994，16(9)：61-65.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄Ⅱ-Ⅺ.