，，

(1.青島科技大學(xué)化學(xué)院，山東 青島 266042；2.青島九龍生物醫(yī)藥有限公司，山東 膠州 266319)

2008年初，美國及歐洲等12個(gè)國家發(fā)生了嚴(yán)重的肝素鈉(Heparin sodium)注射液不良反應(yīng)事件[1]，引發(fā)數(shù)百例病人產(chǎn)生過敏反應(yīng)[2～5]，最終導(dǎo)致約百例病人死亡[6～8]，此批肝素鈉原料中的類肝素雜質(zhì)多硫酸化硫酸軟骨素(Oversulfated chondroitin sulfate，OSCS)[3]，可能為引起病人不良過敏反應(yīng)的異常雜質(zhì)[4]。隨后在數(shù)批肝素鈉及低分子肝素鈉中均發(fā)現(xiàn)此雜質(zhì)[9,10]。各國專家從分子結(jié)構(gòu)、藥理、臨床等方面對(duì)OSCS的毒性進(jìn)行了論證。2008年6月，Kishimoto等[11]證實(shí)OSCS是引發(fā)過敏反應(yīng)的污染物。2009年初，Zhang等[6]證實(shí)OSCS有毒，可能是致百例病人死亡的原因。關(guān)于OSCS的來源也有多種說法，Marco等[3]根據(jù)OSCS的結(jié)構(gòu)認(rèn)為OSCS不是天然存在，而是人工合成的。Keire等[12]認(rèn)為OSCS是人工半合成的，在巨大經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，人為添加到肝素鈉中。Pan等[13]指出OSCS更可能來源于多硫酸化的糖胺聚糖廢料。雖然對(duì)OSCS的來源和致病原因有待統(tǒng)一，但各國專家普遍認(rèn)為肝素鈉中的OSCS必須除去。因此，肝素鈉中OSCS的檢測(cè)至關(guān)重要。

OSCS的結(jié)構(gòu)、電荷密度、分子量、抗凝活性均與肝素(Heparin,HP)相似[6]，到目前為止，約有近十種檢測(cè)方法應(yīng)用到HP與OSCS的鑒別中。其中，核磁共振波譜法、高效液相色譜法、電泳法、紅外光譜法、電化學(xué)法、熒光檢測(cè)法等顯示出良好的應(yīng)用前景。

1 肝素鈉與OSCS的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

糖類藥物肝素鈉是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成的粘多糖硫酸酯鈉鹽，糖環(huán)的連接方式主要是1，4位連接，主要重復(fù)單元為氨基葡萄糖(GlcNs6s)和艾杜糖醛酸(IdoA2s),平均分子量為12 000～15 000[6,14]，作為抗凝劑廣泛應(yīng)用于血液透析、外科手術(shù)、腎臟透析等治療[15～17]，臨床應(yīng)用已有75年的歷史[18]。目前，肝素鈉主要從豬小腸粘膜中分離純化獲得[19,20]，如此復(fù)雜的大環(huán)境決定了肝素鈉的復(fù)雜性，肝素鈉有多種類似物，如硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS)、OSCS、透明質(zhì)酸(HA)、多硫酸化硫酸皮膚素(OSDS)、多硫酸化透明質(zhì)酸(OSHA)等[6]。其中CS是肝素鈉常含有的雜質(zhì)，DS具有和肝素鈉非常相似的結(jié)構(gòu)。CS與肝素鈉結(jié)構(gòu)的主要不同點(diǎn)在于糖環(huán)的連接方式，CS的糖環(huán)為1,3位連接，CS的主要重復(fù)單元為D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖[21]。HP、CS、DS、OSCS結(jié)構(gòu)中的主要二糖單元見圖1。

圖1 HP、CS、DS、OSCS的主要二糖單元

2 肝素鈉中OSCS的測(cè)定方法

2.1 核磁共振波譜法

Marco等[3]應(yīng)用高分辨率核磁共振波譜法對(duì)肝素鈉中的潛在污染物進(jìn)行了分析。首先通過核磁共振氫譜分析發(fā)現(xiàn)污染肝素鈉比正常肝素鈉多了許多新信號(hào)，如化學(xué)位移2.16 ppm處的信號(hào)不同于肝素鈉的正常信號(hào)2.04 ppm和已知雜質(zhì)DS的正常信號(hào)2.08 ppm；碳譜分析表明，污染肝素鈉比正常肝素鈉多了幾個(gè)信號(hào)，如化學(xué)位移25.6 ppm和53.5 ppm處的信號(hào)與DS的信號(hào)24.8 ppm和54.1 ppm也不同，表明污染肝素鈉中有氧取代的N-乙酰半乳糖胺；通過二維核磁共振測(cè)試(如HSQC和TOCSY、COSY、ROSEY譜)，進(jìn)一步證實(shí)氫譜化學(xué)位移2.08 ppm處的信號(hào)為DS，通過詳細(xì)的結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)污染物的重復(fù)二糖單元為葡萄糖醛酸1,3位連接N-乙酰半乳糖胺，該二糖結(jié)構(gòu)有著不同尋常的硫酸化模式，葡萄糖醛酸的2位與3位被硫酸化、半乳糖胺的4位與6位被硫酸化，從而確定污染物為OSCS。

Zhang等[6]對(duì)1941～2008年期間的31批不同來源的肝素鈉樣品進(jìn)行了1HNMR檢測(cè)，指出污染物OSCS、OSDS、OSHA的乙?；屑谆盘?hào)的化學(xué)位移(ppm)分別為2.15、2.14、2.17。分別提供了純肝素鈉加入20種類肝素污染物的1HNMR譜圖，得出這20種污染物的檢出限為0.5%～10%，其中OSCS的檢出限為0.5%。

Keire等[18]應(yīng)用核磁共振氫譜法檢測(cè)肝素鈉粗品中的污染物OSCS，檢出限和定量檢出限分別為0.1%和0.3%。

Sitkowski等[22]應(yīng)用DOSY-NMR方法對(duì)肝素鈉及低分子肝素鈉(LMWH)中的污染物OSCS進(jìn)行了分析。肝素鈉、OSCS、LMWH的分子量不同，在DOSY-NMR實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為平動(dòng)擴(kuò)散系數(shù)(Dt)的不同，分子量大的物質(zhì)(如OSCS)，擴(kuò)散較慢，則Dt較小；反之，分子量小的物質(zhì)(如LMWH)，擴(kuò)散較快，則Dt較小。根據(jù)Dt值就可對(duì)樣品的純度進(jìn)行判斷。研究結(jié)果表明：OSCS、LMWH、肝素鈉相應(yīng)的N-乙酰氨基信號(hào)的Dt分別為：0.30×10-10m2·s-1、1.05×10-10m2·s-1、0.38×10-10m2·s-1；根據(jù)Dt值不僅能對(duì)污染物OSCS進(jìn)行鑒別，而且還能區(qū)分開LMWH與肝素鈉。但對(duì)國際市場上OSCS污染的低分子肝素鈉樣品進(jìn)行DOSY-NMR實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：OSCS的N-乙酰氨基特征峰的化學(xué)位移為2.15 ppm、Dt為0.70×10-10m2·s-1，而不是0.30×10-10m2·s-1。針對(duì)這一矛盾，作者提出假設(shè)：隨著肝素鈉在堿性條件下降解為低分子肝素鈉，此時(shí)OSCS也降解為低分子多硫酸化硫酸軟骨素(LOSCS),LOSCS和OSCS的N-乙酰氨基特征峰在相同的化學(xué)位移2.15 ppm處，故Dt增大。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，向該樣品中加入純的OSCS，結(jié)果化學(xué)位移2.15 ppm處的信號(hào)強(qiáng)度增加、Dt由0.70×10-10m2·s-1變?yōu)?.50×10-10m2·s-1，驗(yàn)證了作者的假設(shè)。

Peter等[9]應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)2D1H-1HNMR NOESY譜鑒別肝素鈉中潛在的污染物，如OSCS、CSA、DS等。當(dāng)前常規(guī)1D1HNMR主要是通過污染物與肝素鈉中N-乙酰氨基信號(hào)不同來鑒別和區(qū)分的，化學(xué)位移主要集中在2.00～2.20 ppm，對(duì)于某些沒有N-乙酰氨基的多糖污染物或其N-乙酰氨基與肝素鈉N-乙酰氨基信號(hào)部分或完全重疊的污染物，常規(guī)1D1HNMR方法很難進(jìn)行鑒別，而2D1H-1HNMR NOESY譜不只局限于N-乙酰氨基的信號(hào)，同時(shí)將相應(yīng)的鑒別信號(hào)延伸至糖環(huán)信號(hào)部分，彌補(bǔ)了常規(guī)1D1HNMR方法的不足。此外，作為常規(guī)1D1HNMR的補(bǔ)充，對(duì)肝素鈉中污染物提供更為精細(xì)的指紋分析與鑒別，可為鑒別結(jié)果提供更為可靠的依據(jù)。Peter等首先對(duì)2D1H-1HNMR NOESY實(shí)驗(yàn)條件、采樣、處理參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化；然后對(duì)肝素鈉和污染物OSCS、CSA、DS分別進(jìn)行2D1H-1HNMR NOESY測(cè)試，得到肝素鈉、OSCS、CSA、DS的標(biāo)準(zhǔn)參照譜圖；最后對(duì)OSCS污染的肝素鈉和DS污染的肝素鈉進(jìn)行2D NOESY實(shí)驗(yàn)，從2D譜中分別抽取出1D OSCS譜、1D DS譜，與標(biāo)準(zhǔn)參照譜圖進(jìn)行比對(duì)，確定污染物為OSCS和DS。作者還對(duì)含有少量CSA雜質(zhì)的肝素鈉樣品進(jìn)行了2D NOESY實(shí)驗(yàn)，CSA的N-乙酰氨基的信號(hào)與肝素鈉的信號(hào)重疊，且CSA在3～6 ppm間糖環(huán)信號(hào)均被肝素鈉糖環(huán)強(qiáng)信號(hào)所掩蓋，因此常規(guī)1D1HNMR很容易忽視此雜質(zhì)，但在2D1H-1HNMR NOESY實(shí)驗(yàn)中，通過精密的指紋分析確定了雜質(zhì)CSA的存在。

Keire等[12]應(yīng)用500 MHz1HNMR分析了肝素鈉類似物CSA、CSB、OS-CSA、OS-CSB，發(fā)現(xiàn)各化合物的特征峰化學(xué)位移(ppm)分別為：2.02、2.08、2.15、2.09/2.12。作者指出了核磁共振氫譜的缺陷：HS、OS-HS、OS-HEP和局部硫酸化CSA的特征峰的化學(xué)位移和肝素鈉特征峰的化學(xué)位移在同一位置2.04 ppm處，單用核磁共振氫譜很難鑒別這些污染物。

高照明等[23]對(duì)肝素鈉、OSCS標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了1HNMR測(cè)試并對(duì)譜圖進(jìn)行了全歸屬，指出肝素鈉和OSCS的乙酰甲基特征峰的化學(xué)位移在2.15 ppm處；考察了測(cè)試條件，結(jié)果表明：當(dāng)樣品濃度為25 mg·(0.6 mL)-1、定標(biāo)物TSP含量為0.020%(質(zhì)量體積比)、樣品的旋轉(zhuǎn)為12 Hz、處理參數(shù)(LB)為1.0、儀器頻率為500 MHz時(shí)，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出肝素鈉中的污染物；應(yīng)用核磁共振內(nèi)標(biāo)法定量分析了肝素鈉中OSCS[24]，結(jié)果表明雜質(zhì)OSCS在0.1%～5%范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，擬合線性回歸方程為：y=2.7929x-0.0317，相關(guān)系數(shù)R=0.9994，檢出限為0.1%，平均回收率為98.1%(n=6)，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD為0.35%(n=6)；表明該方法作為多糖藥物肝素鈉中雜質(zhì)的定量分析方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 高效液相色譜法

Trehy等[20]應(yīng)用強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法對(duì)污染肝素鈉中的OSCS及DS進(jìn)行了檢測(cè)，用pH值為3的0.125～2.5 mol·L-1的氯化鈉磷酸緩沖溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測(cè)波長為215 nm，DS、HP、OSCS的保留時(shí)間分別約為16.0 min、 19.2 min、 22.0 min，OSCS的檢出限和定量檢出限分別為0.03%和0.1%，DS的檢出限和定量檢出限分別為0.1%和0.8%。

Keire等[12]對(duì)肝素鈉中的天然雜質(zhì)(CSA,DS,HS)及人工合成污染物(OS-CSA,OS-CSB,OS-HS,OS-HEP)進(jìn)行了強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法分析，結(jié)果表明：此類污染物的檢出限范圍為0.05%～0.12%，其中DS的檢出限為0.1%、CSA的檢出限為0.03%。

Keire等[18]應(yīng)用強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法分析了肝素鈉粗品中的OSCS，檢出限及定量檢出限分別為0.03%及0.09%；進(jìn)一步改進(jìn)方法，即將肝素鈉粗品溶于100 mg·mL-1的2.5 mol·L-1氯化鈉溶液中，檢出限及定量檢出限分別提高至0.02%和0.07%。

趙峽等[25]應(yīng)用柱前衍生高效液相色譜法分析了問題肝素鈉中OSCS的含量，基于肝素鈉和OSCS在單糖組成上的差別，采用3 mol·L-1三氟乙酸，將問題肝素鈉在110 ℃下充氮封管水解4 h，再在堿性條件下與 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后采用C18反相色譜柱，以0.1 mol·L-1磷酸鹽(pH=6.7)緩沖溶液-乙腈(體積82∶18)為流動(dòng)相,在流速 1.0 mL·min-1、柱溫25 ℃及紫外檢測(cè)波長245 nm的條件下進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果表明，在0.2～4.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與OSCS的濃度具有良好的線性關(guān)系，以色譜峰面積(A,×10-5mAu)為橫坐標(biāo)、OSCS的濃度(p,mg·mL-1)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸方程為A=34.7071p-0.9811(R=0.9987)。此方法具有操作簡單、靈敏度高及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

2.3 電泳法

Valeria等[4]應(yīng)用高靈敏度的混合物聚合體電動(dòng)色譜系統(tǒng)檢測(cè)肝素鈉樣品中的雜質(zhì)OSCS和DS。電動(dòng)色譜系統(tǒng)由0.5%(質(zhì)量體積比)β-環(huán)糊精、0.4%(質(zhì)量體積比)Tetronic 1107和pH值3.5的0.4 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液組成。最佳電泳條件為：長50 cm、直徑70 μm的未經(jīng)二氧化硅涂布的毛細(xì)管，外加電壓為-7 kV，檢測(cè)溫度為300 ℃、紫外檢測(cè)波長為200 nm。此方法具有較低的檢出限，OSCS和DS的檢出限分別為0.07%(0.07 μg·mL-1)、0.1%(0.1 μg·mL-1)，定量檢出限分別為0.2%(0.2 μg·mL-1)、0.3%(0.3 μg·mL-1)。

肝素鈉不良過敏反應(yīng)事件中，在低分子肝素鈉中也發(fā)現(xiàn)了污染物OSCS[19]。Zhang等[26]應(yīng)用5種方法(亞硝酸法、肝素裂解酶I法、高碘酸鹽氧化法、堿處理法、雙氧水氧化法)對(duì)肝素鈉樣品、OSCS樣品及兩者1∶1的混合樣品進(jìn)行解聚，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法對(duì)解聚產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，亞硝酸法、肝素裂解酶I法、高碘酸鹽氧化法均可以解聚肝素鈉制備低分子肝素鈉，但均不能解聚OSCS，用這三種方法制備的混合樣品中，低分子肝素鈉中的OSCS和解聚前樣品的一樣，均為高分子OSCS；堿處理法和雙氧水氧化法均可以解聚肝素鈉和OSCS，且堿處理方法中肝素鈉的解聚程度高于OSCS，雙氧水氧化法中肝素鈉的解聚程度低于OSCS，這兩種方法制備的混合樣品中，低分子肝素鈉中含有的OSCS為低分子OSCS，最后用1HNMR對(duì)OSCS的解聚產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證。

王皓等[27]采用離子交換色譜法從污染肝素鈉原料中分離出OSCS，建立了分步醋酸纖維素薄膜電泳法分析污染肝素鈉中OSCS含量的方法。結(jié)果表明：先以0.05 mol·L-1醋酸鋇緩沖溶液(pH值5.0)電泳、再以0.15 mol·L-1醋酸鋅緩沖溶液(pH值6.3)電泳，可以將肝素鈉和OSCS完全分開，檢出限為0.1 g·L-1，通過灰度積分建立定量校準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9934、平均回收率為102.1%～106.1%、RSD為4.1%～6.0%。該方法簡便、快速、成本低。

2.4 紅外光譜法

Spencer等[28]應(yīng)用近紅外反射及拉曼光譜學(xué)技術(shù)對(duì)國內(nèi)外69批次肝素鈉中的OSCS進(jìn)行了檢測(cè)。根據(jù)28批次樣品中的3種主要成分肝素鈉、OSCS、糖胺聚糖建立了最小偏二乘法回歸模型，使得樣品的近紅外與拉曼譜圖和樣品的毛細(xì)管電泳分離圖譜相關(guān)，并成功預(yù)測(cè)了41批樣品的組成成分。該方法篩選肝素鈉樣品具有迅速、無損等優(yōu)點(diǎn)。

2.5 電化學(xué)法

Gemene等[29]和Wang等[30,31]應(yīng)用電位聚陰離子傳感器對(duì)肝素鈉中的OSCS進(jìn)行了定量分析，此傳感器是基于電勢(shì)測(cè)定分析方法的動(dòng)力學(xué)模式，通過調(diào)整試樣的濃度范圍來完成的。聚合物傳感器的離子選擇性電極是涂有親脂性陰離子交換劑三十二烷基甲基氯化銨(TDMAC)的聚氯乙烯薄膜。由于OSCS的電荷密度比肝素鈉大，與TDMAC形成的離子對(duì)具有較大的平衡常數(shù)，而聚陰離子傳感器平衡電勢(shì)的大小直接與聚陰離子的電荷密度成正比，即可對(duì)OSCS進(jìn)行定量分析。即使試樣中OSCS的濃度足夠低，也會(huì)引起相界面平衡電勢(shì)的變化，因此該方法具有檢出限較低的優(yōu)點(diǎn)，定量檢出限為0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

2.6 熒光檢測(cè)法

Lühn等[32]和Alban等[33]應(yīng)用微孔板熒光檢測(cè)法對(duì)肝素鈉中的OSCS進(jìn)行了定量檢測(cè)。建立了由肝素鈉-甲基丙烯酰胺組成的熒光傳感器，此聚合物熒光性只依賴于肝素鈉及OSCS的濃度。首先用肝素酶I對(duì)肝素鈉樣品進(jìn)行降解，待肝素鈉完全降解后分離出OSCS，再單獨(dú)檢測(cè)OSCS的熒光性。該方法檢測(cè)OSCS的檢出限及定量檢出限分別為0.5%、0.6%。

3 結(jié)語

迄今為止，肝素鈉中OSCS的檢測(cè)方法已有多種，其中核磁共振氫譜法和毛細(xì)管電泳法是最早應(yīng)用的方法，核磁共振氫譜法具有快速、操作簡單、樣品無損、檢出限低、譜圖直觀等優(yōu)點(diǎn)而被美國及歐洲藥典收錄；毛細(xì)管電泳法操作復(fù)雜，分析時(shí)間長，逐漸被近期發(fā)展的強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法所替代；紅外光譜譜峰重疊，結(jié)果較難判斷且檢出限較高；電化學(xué)法和熒光檢測(cè)法具有較低的檢出限和較高的靈敏度，但人為操作誤差大、重復(fù)性有待提高。綜合而言，OSCS的定量分析方法中，強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法的檢出限最低，核磁共振氫譜法結(jié)合強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法可保證肝素鈉不受OSCS的污染，可作為肝素鈉質(zhì)量控制的分析方法。

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