磁流體熱療對肺癌A549裸鼠移植瘤抑制作用的實驗研究

胡潤磊 李 滸 柯賢福 王國卿 魏東山 王 煒

局部熱療是近年來發(fā)展較快的一種腫瘤治療方法，傳統(tǒng)的熱療方法主要有射頻熱療、微波熱療和超聲熱療等。但是，射頻熱療過程中由于電場較發(fā)散，不能對腫瘤準(zhǔn)確的聚焦，從而導(dǎo)致腫瘤周圍脂肪過熱。微波的穿透深度非常有限，常只能作淺表腫瘤的熱療;超聲不能穿透含氣空腔，因此應(yīng)用比較局限。磁流體熱療(magnetic fluid hyperthernia，MFH)是將納米技術(shù)和熱療技術(shù)相結(jié)合的一種新興熱療方法。Jordan首先開展了此方面的研究，將磁流體通過直接注射的方式到達腫瘤內(nèi)部，磁流體在交變磁場下通過Neel松弛機制升溫［1，2］。由于磁性顆粒是通過直接注射的方式到達腫瘤內(nèi)部，周圍正常組織由于沒有磁性顆粒的分布，升溫不明顯或不升溫，因此大大提高了熱療的靶向性。本研究將Fe3O4磁流體在交變磁場作用下對肺癌A549裸鼠移植瘤進行了初步研究，研究了其作用機制，探討了磁流體熱療治療肺癌的可行性。

材料與方法

1.主要材料:(1)試劑:主要試劑:MTT(四唑氮鹽)，DMSO(二甲亞砜)，胰蛋白酶，細胞培養(yǎng)基粉(RPMI1640)由Sigma公司提供。(2)細胞株:人肺癌細胞株A549，由杭州昊天生物有限公司提供。用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。(3)磁流體:納米級Fe3O4顆粒，采用化學(xué)共沉淀法制成膠體混懸液，呈黑色。樣品粒徑范圍為10～40nm，磁飽和度:磁飽和強度是360GS。樣品使用前均以超聲波處理5min，使Fe3O4顆粒分布更均勻。(4)實驗動物:4～5周齡BALB/C雌性裸小鼠32只，質(zhì)量20～24g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2008－0035。飼養(yǎng)于浙江省實驗動物中心實驗動物屏障系統(tǒng)，空氣潔凈度萬級，換氣次數(shù)15次/小時，溫度21～24℃，濕度75% ～80%。實驗動物使用許可證號:SYXK(浙)2008－0113。(5)主要儀器設(shè)備:高頻感應(yīng)加熱機:型號:SP－04AC 4kW，深圳市雙平電源技術(shù)有限公司提供。頻率為率100～250kHz，感應(yīng)線圈由4匝直徑為4mm的銅管平行繞成內(nèi)徑為3cm，長為4cm的線圈，銅管內(nèi)通循環(huán)水。①流式細胞儀(FCM):型號EPICS XL型，美國Coulter公司;②透射電鏡:JEM－1230型透射電鏡，日本JEOL公司;③測溫設(shè)備:光纖溫度傳感器，YF－200。

2.實驗方法:(1)人肺癌A549裸鼠移植瘤模型的建立:將處于對數(shù)生長期的人肺癌 A549細胞，以0.25%胰酶+0.02%EDTA液進行消化，以血細胞計數(shù)板進行計數(shù)后用不含血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋，調(diào)整細胞濃度為1×107/ml。用1ml注射器分別在裸鼠背部皮下注射上述細胞懸液0.2ml。觀察小鼠精神、飲食及排便等情況，每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)、短徑(b)，按公式V=ab2/2，估算腫瘤近似體積。(2)磁流體熱療:接種后第21天，各組移植瘤平均直徑約6mm，在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上將裸鼠隨機分為:對照組、低劑量組，中劑量組、高劑量組，每組8只。2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉。①對照組:予以1次進針、多點注射0.2ml的生理鹽水;②低劑量組:予以1次進針、多點注射0.2ml濃度為67.5mg/ml的磁流體，含磁流體約13.5mg;③中劑量組:予以1次進針、多點注射0.2ml濃度為90.0mg/ml的磁流體，含磁流體約18mg;④高劑量組:予以1次進針、多點注射0.2ml濃度為112.5mg/ml的磁流體，含磁流體約22.5mg。3個實驗組在注射磁流體后24h，分別在交變磁場作用下作用30min，光纖傳感器測量腫瘤內(nèi)部和肛門的溫度。(3)病理學(xué)觀察:加溫后48 h，各組隨機挑選2只裸鼠，離斷法處死，迅速取出瘤體，剖開經(jīng)10%甲醛緩沖液固定，石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織學(xué)變化。另一部分瘤體4%預(yù)冷戊二醛4℃固定過夜，1%的鋨酸溶液固定樣品1～2h，將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70℃加熱過夜，在Reichert超薄切片機中切成70～90nm的薄片，用檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，透射電鏡中觀察。(4)熱療對荷瘤小鼠瘤體的抑制作用:熱療后第21天，離斷法處死所有的荷瘤小鼠，剝?nèi)×鲶w，天平稱重。根據(jù)瘤體的體積計算各組的腫瘤體積抑制率，腫瘤體積抑制率=(1－實驗組瘤體體積/對照組瘤體體積)×100%。根據(jù)各組荷瘤小鼠瘤重計算腫瘤的質(zhì)量抑制率，腫瘤質(zhì)量抑制率=(1－實驗組瘤體質(zhì)量/對照組瘤體質(zhì)量)×100%。

結(jié) 果

1.移植瘤生長情況:裸鼠一般情況及皮下成瘤:32只裸鼠成瘤，成瘤率100% ，瘤結(jié)節(jié)形成時間為細胞種植后第4～13天，集中在第8～10天。腫瘤細胞種植后第21天，腫瘤直徑平均達6mm。成瘤后早期裸鼠的體質(zhì)量和活動情況沒有明顯改變，隨著腫瘤形成并逐漸增大，裸鼠逐漸出現(xiàn)消瘦，活動減少。

2.磁流體熱療對移植瘤的抑制作用:磁流體在低劑量組、中劑量組、高劑量組瘤體的平均溫度分別為41.3℃、44.5℃、46.8℃，小鼠肛門溫度在 30 ～ 34℃之間。熱療后第21天，4組的體積分別為:對照組831.0 ±126.2mm3、低劑量組 713.2 ±157.1mm3、中劑量組399.2 ±199.2mm3、高劑量組 247.3 ±102.0mm3。低、中、高劑量組體積抑制率分別為14.1%、51.9%、70.2%。方差分析組間差異顯示，與對照組比較，中劑量組、高劑量組腫瘤生長明顯緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。低劑量組的腫瘤體積與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)，各組腫瘤體積增長趨勢見圖1。

圖1 各組A549肺癌裸鼠移植瘤生長曲線

4組的瘤體重量分別為:對照組1.71±1.11g，低劑量組1.51 ±0.25g，中劑量組 0.93 ±0.40g，高劑量組0.65 ±0.21g，低、中、高劑量組質(zhì)量抑瘤率分別為11.7%、45.6%、62.0%，方差分析組間差異顯示，與對照組比較，中劑量組、高劑量組腫瘤生長明顯緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組的腫瘤重量與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

表1 不同劑量的磁流體熱療后對小鼠瘤體體積和質(zhì)量抑制作用

3.熱療后移植瘤的病理學(xué)觀察:(1)大體觀察:磁流體熱療后，對照組的移植瘤體積進行性增長，瘤體表面光整。實驗組瘤體表面顏色出現(xiàn)暗淡(磁流體的顏色為褐色)，出現(xiàn)表面結(jié)痂，進而出現(xiàn)局部壞死，壞死脫落后表面凹凸不平，腫瘤生長明顯減慢，以高劑量組瘤體最明顯。(2)光鏡觀察:低劑量組肺癌細胞在熱療后正常形態(tài)無明顯改變，細胞區(qū)域看到磁流體的分布，中劑量組的肺癌細胞在熱療后出現(xiàn)局部凝固樣壞死改變，表現(xiàn)為嗜酸性增強，在壞死區(qū)域有磁流體的分布。高劑量組肺癌細胞同樣出現(xiàn)凝固樣壞死改變，但壞死區(qū)域較中劑量組明顯增加，在壞死區(qū)域有磁流體的分布(圖2)。

圖2 各組腫瘤在磁流體熱療后的光鏡下表現(xiàn)(HE×400)

4.電鏡觀察:低劑量組肺癌細胞在熱療后與對照組肺癌細胞比較無明顯變化;中劑量組肺癌細胞出現(xiàn)典型的凋亡樣改變，表現(xiàn)為染色體邊聚、胞質(zhì)空泡化、細胞核裂解;高劑量組肺癌細胞核呈現(xiàn)溶解，正常細胞結(jié)構(gòu)消失，呈壞死表現(xiàn)(圖3)。

圖3 各組肺癌細胞磁流體熱療后的透射電鏡觀察

討 論

肺癌是嚴(yán)重危害人民生命健康的常見疾病。其發(fā)病率和病死率已居所有癌癥之首［1］。但由于大部分患者發(fā)現(xiàn)已屬晚期，手術(shù)效果差，傳統(tǒng)的放化療由于不良反應(yīng)大且價格昂貴，多數(shù)患者不能耐受。因此，探索一種新的有效的治療肺癌的方法成為我們工作首要任務(wù)。近年來，以射頻為主的傳統(tǒng)的熱療方法對肺癌的局部控制起到了良好的作用，但是射頻加溫由于電場較發(fā)散，不能對腫瘤準(zhǔn)確定位，導(dǎo)致脂肪過熱，因此靶向性差，應(yīng)用比較局限［2］。

磁流體熱療的一個優(yōu)點就是高度靶向性和特異性，我們將磁流體熱療對裸鼠肺癌移植瘤進行治療實驗，結(jié)果證實磁流體在腫瘤內(nèi)部可以升溫至有效的治療溫度，而小鼠肛門溫度卻穩(wěn)定在30～34℃之間，說明周圍正常組織沒有明顯的升溫，初步實現(xiàn)了磁流體熱療的靶向性。

研究證實，熱療的有效溫度是 ＞42.0℃［3］。Ivkov等［4］報道當(dāng)磁流體的溫度升高至有效溫度以后，磁流體熱療對腫瘤的抑制效果與溫度呈劑量－效果依賴關(guān)系。我們將不同劑量的磁流體注射到瘤體內(nèi)部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量組的腫瘤內(nèi)部溫度升溫至41.3℃左右，沒有明顯的抑瘤效果，而中、高劑量組的溫度均升高至42.0℃以上，抑瘤效果明顯，高劑量組的抑瘤效果較中劑量組明顯(P＜0.05)。與上述報道基本一致，證實了磁流體熱療的可操作性。

研究表明，熱療可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，導(dǎo)致壞死，在42.0～46.0℃條件下，腫瘤細胞已凋亡為主，在46.0℃以上的條件下，高溫可以直接導(dǎo)致腫瘤細胞壞死［5］。我們通過光鏡觀察，中、高劑量組腫瘤細胞加熱后大量出現(xiàn)凝固性壞死的征象，表現(xiàn)為嗜酸性增強，正常細胞結(jié)構(gòu)消失，核碎裂、溶解;在壞死的一些區(qū)域偶可見出血灶，表現(xiàn)為壞死腫瘤細胞周圍大量的紅細胞分布，血管破裂;磁流體分布于凋亡和壞死的區(qū)域中。電鏡觀察中劑量組腫瘤細胞呈典型的凋亡樣改變，表現(xiàn)為染色質(zhì)邊集、胞質(zhì)空泡化、細胞核裂解，在高劑量組，細胞核呈現(xiàn)溶解，正常細胞結(jié)構(gòu)消失，呈壞死表現(xiàn)。證實磁流體熱療可以誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，在高溫時直接導(dǎo)致肺癌細胞壞死。

但磁流體熱療對腫瘤的具體作用機制目前還有爭議，翟羽等［6］研究發(fā)現(xiàn)，磁流體熱療后實驗組腫瘤的細胞的凋亡無明顯增加，誘導(dǎo)凋亡不是抑制移植瘤生長的主要原因，可能與研究的條件、腫瘤的屬性等因素有關(guān)。

總之，我們的結(jié)果證實磁流體熱療對肺癌裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，熱療后肺癌細胞呈現(xiàn)凋亡和壞死樣改變，在有效溫度范圍的抑瘤效果與溫度呈劑量－效果依賴關(guān)系。將為磁流體熱療在肺癌領(lǐng)域的進一步深入研究打下良好的基礎(chǔ)。

1 Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics［J］.Ca Cancer J Clin，2005，55:74 －108

2 Samanta B，Yan H，F(xiàn)ischer NO，et al.Protein－passivated Fe3O4 nanoparticles:low toxicity and rapid heating for thermal therapy［J］.J Mater Chem，2008，18(11):1204 －1208

3 Tseng HY，Lee GB，Lee CY，et al.Localised heating of tumours utilising injectable magnetic nanoparticles for hyperthermia cancer therapy［J］.IET Nanobiotechnol，2009，3(2):46－54

4 Ivkov R，DeNardo SJ，Daum W，et al.Application of high amplitude alternating magnetic fields for heat induction of nanoparticles localized in cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(19 Pt 2):7093－7103

5 Shellman YG，Howe WR，Miller LA，et al.Hyperthermia induces endoplasmic reticulum－mediated apoptosis in melanoma and non－melanoma skin cancer cells［J］.J Invest Dermatol，2008，128(4):949 －956

6 翟羽，謝弘，古宏晨.葡聚糖磁流體熱處理對小鼠H22移植瘤生長的影響及機制初探［J］.腫瘤防治研究，2006，33(3):141 －144