陳 林,王增亮,趙群飛,高淑紅,葉蕊芳

(1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海 200032)

林可霉素(Lincomycin)是由林可鏈霉菌(Streptomyceslincolnensis)產(chǎn)生的第一代林可酰胺類抗生素，主要用于治療革蘭氏陽性菌所引起的感染。因其對組織和細(xì)胞穿透力強(qiáng)，應(yīng)用方便(不需皮試)，廣泛應(yīng)用于臨床[1，2]。我國自1975年工業(yè)生產(chǎn)林可霉素以來，通過菌種選育和工藝改進(jìn)，生產(chǎn)水平不斷提高，但仍然與國際先進(jìn)水平存在較大的差距。

近年來，隨著基因組學(xué)和DNA重組技術(shù)的快速發(fā)展，人們可以合理、定向且高效地對微生物細(xì)胞內(nèi)生物合成相關(guān)的基因進(jìn)行遺傳改造。相比盲目、隨機(jī)的傳統(tǒng)誘變方法(如自然選育、誘變育種、原生質(zhì)體融合等)，合理的遺傳改造更能特異地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度。

遺傳改造的關(guān)鍵是在基因和蛋白功能水平上認(rèn)識和理解復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成和調(diào)控機(jī)制。早在20世紀(jì)90年代，35 kb包含完整林可霉素生物合成基因簇的DNA序列就已被克隆[3，4]，但到目前為止，對林可霉素生物合成基因功能的相關(guān)研究仍然很少，基本上都局限在序列比對和生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上進(jìn)行的推測。

根據(jù)對林可霉素生物合成基因的生物信息學(xué)分析，推測該基因簇中的基因lmbU是林可霉素生物合成的調(diào)控基因。作者采用同框敲除和基因倍增的方式對S.lincolnensisN9的lmbU基因功能進(jìn)行初步的研究，為遺傳改造林可霉素生產(chǎn)菌以提高林可霉素的產(chǎn)量做出有益的探索。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與質(zhì)粒

林可鏈霉菌S.lincolnensisN9，自行保藏；大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliET12567(pUZ8002)[5]、克隆質(zhì)粒pSP72、溫敏性質(zhì)粒pKC1139[6]、整合型載體pSOK804[7][含有接合轉(zhuǎn)移復(fù)制子oriT和安普霉素Apramycin抗性基因aac(3)IV]、質(zhì)粒pLL6214(攜帶紅色糖多孢菌紅霉素強(qiáng)啟動子ermE*)，中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。分子生物學(xué)常規(guī)操作方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，10.0 g酵母抽提物，5.0 g氯化鈉，蒸餾水定容至1 L。固體培養(yǎng)基另加20.0 g瓊脂。

TSB培養(yǎng)基：30 gTSB，蒸餾水定容至1 L。

MS培養(yǎng)基：20.0 g黃豆餅粉，20.0 g甘露醇，20.0 g瓊脂粉，自來水定容至1 L。

1.3 重組質(zhì)粒pLIN-DU、pLIN-U的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)2008年6月公布的S.lincolnensisATCC 25466林可霉素生物合成基因簇序列信息(Accession No.EU 124663)設(shè)計(jì)相關(guān)引物。PCR克隆基因lmbU左臂所用引物為UL-F：5′-ATAGAATTC(EcoRⅠ)CCTGGAGGTAGTGGAACGCG-3′，UL-R：5′-ATAAAGCTT(HindⅢ)GGCACATCGCGTCGGAGTAC-3′；PCR克隆基因lmbU右臂所用引物為UR-F:5′-ATAAAGCTT(HindⅢ)GTCGCTGTACCGGGTCTGAC-3′，UR-R：5′-ATATCTAGA(XbaⅠ)CGACAGGCTCAGGAATCGGC-3′。

同時(shí)，為了利用lmbU基因自身的啟動子，設(shè)計(jì)引物時(shí)往基因lmbU上游延伸了200 bp左右。獲取基因lmbU的上游引物L(fēng)IN-4-F：5′-GCTCTAGA(XbaⅠ)GCAATGATGCTGGTTCCGCCAAGC-3′和下游引物L(fēng)IN-4-R：5′-CCCAAGCTT(HindⅢ)ACTAGT(SpeⅠ)GTGGAGGTGATGGCTGGTGGGCAG-3′。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建過程

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendoff熱循環(huán)儀上進(jìn)行，條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min；采用1%的瓊脂糖凝膠電泳回收目標(biāo)條帶；將EcoRⅠ/HindⅢ酶切后的左臂UL(1.77 kb)、HindⅢ/XbaⅠ酶切后的右臂UR(1.74 kb)、XbaⅠ/HindⅢ酶切后lmbU基因片段(0.95 kb)分別連入pSP72相應(yīng)位點(diǎn)后獲得重組克隆質(zhì)粒pCLDU-1、pCLDU-2、pCLU-1，由英駿生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證。

用限制性酶EcoRⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/HindⅢ分別從測序正確的克隆質(zhì)粒pCLDU-1和pCLDU-2上酶切下左臂UL和右臂UR，克隆至EcoRⅠ/XbaⅠ酶切后的pKC1139質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pLIN-DU(如圖1所示)。同理，用限制性酶XbaⅠ/HindⅢ從測序正確的克隆質(zhì)粒pCLU-1上酶切下lmbU基因片段，克隆至XbaⅠ/HindⅢ酶切后的pLL6214質(zhì)粒上，獲得質(zhì)粒pCLU-2；再用EcoRⅠ/HindⅢ酶切下1.44 kb含紅霉素啟動子和lmbU基因的目的片段，克隆至EcoRⅠ/HindⅢ酶切后的pSOK804載體上，獲得重組質(zhì)粒pLIN-U(如圖2所示)。

圖1 重組質(zhì)粒pLIN-DU的構(gòu)建

圖2 重組質(zhì)粒pLIN-U的構(gòu)建

1.4 突變菌的獲得與驗(yàn)證

將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pLIN-DU、pLIN-U分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliET12567(pUZ8002)中，通過屬間接合轉(zhuǎn)移[9]方式導(dǎo)入到S.lincolnensisN9。獲得接合子之后，用于中斷l(xiāng)mbU基因的接合子在Am抗性篩選條件下37 ℃培養(yǎng)，利用pKC1139質(zhì)粒上的溫敏性復(fù)制子，促使質(zhì)粒與鏈霉菌基因組發(fā)生第一次同源重組，然后置于無抗條件下30 ℃松弛培養(yǎng)2～3代，使兩者發(fā)生第二次同源重組，獲得發(fā)生雙交換后的突變菌LIN-DU；用于倍增lmbU基因的接合子依照pSOK804載體上的整合特點(diǎn)可直接視為突變菌LIN-U。

獲得突變菌后，用引物DU-F：5′-GGTCATG GAGGCGGATGTTG-3′ 和DU-R：5′-CGGTGA CCCAAAGGGCAAGA-3′以及引物PermE-F：5′-GAATTCGGTACCAGCCCGACCCGAG-3′和LIN-4-R對突變菌LIN-DU、LIN-U分別進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.5 突變菌的發(fā)酵驗(yàn)證

突變菌發(fā)酵采用二級培養(yǎng)的方法。以出發(fā)菌S.lincolnensisN9為對照，于30 ℃、220 r·min-1下?lián)u瓶發(fā)酵，在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接入二級發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵7 d。為判斷不同基因型對林可霉素生物合成造成的差異，對于突變菌和出發(fā)菌采用相同的發(fā)酵條件，盡量減少發(fā)酵過程對其表型的影響。

1.6 分析與檢測

發(fā)酵液效價(jià)測定采用杯碟法。

LC-MS檢測條件：采用Phenomenex Luna 5u C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)；檢測波長為210 nm；流動相為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液∶甲醇(40∶60)；恒梯度洗脫，流速為0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pLIN-DU、pLIN-U的驗(yàn)證

獲得重組質(zhì)粒pLIN-DU、pLIN-U后，分別用XhoⅠ和BglⅡ兩組單酶切體系、EcoRⅠ/HindⅢ和XbaⅠ/HindⅢ兩組雙酶切體系進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。

M.DNA Marker DL5000 1,2.pLIN-DU 3,4.pLIN-U

用XhoⅠ單酶切pLIN-DU會形成大小分別為6.72 kb和3.30 kb的目標(biāo)條帶，用BglⅡ單酶切pLIN-DU會形成大小分別為7.92 kb和0.90 kb的目標(biāo)條帶。由圖3A可知，lmbU左右臂拼接的片段(UL和UR)成功插入質(zhì)粒pKC1139中。

用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切pLIN-U會形成大小分別為6.04 kb和1.43 kb的目標(biāo)條帶；而用XbaⅠ/HindⅢ雙酶切pLIN-U會形成大小分別為3.61 kb、2.33 kb和0.94 kb的目標(biāo)條帶。由圖3B可知，外源重組基因片段ermE*+lmbU成功插入載體pSOK804中。以上驗(yàn)證結(jié)果表明重組質(zhì)粒pLIN-DU、pLIN-U均可用于后續(xù)遺傳操作。

2.2 突變菌LIN-DU、LIN-U的PCR驗(yàn)證

圖4 突變菌LIN-DU的同框敲除示意圖

重組質(zhì)粒pLIN-DU導(dǎo)入出發(fā)菌S.lincolnensisN9中會與染色體發(fā)生兩次同源重組(原理如圖4所示)從而使得lmbU基因內(nèi)部序列缺失195 bp。因此，可通過在基因lmbU左右臂內(nèi)部設(shè)計(jì)一對引物DU-F和DU-R對突變菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證。若是野生型或回復(fù)突變型菌株，染色體上lmbU基因是完整的，PCR擴(kuò)增的條帶大小約為1.10 kb左右；而突變菌LIN-DU染色體上lmbU基因內(nèi)部序列有缺失，PCR只能擴(kuò)增出大小約為0.90 kb左右的條帶。PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示。

而重組質(zhì)粒pLIN-U導(dǎo)入出發(fā)菌S.lincolnensisN9中后，外源重組片段ermE*+lmbU會隨著載體pSOK804與染色體上特異位點(diǎn)的整合而一并插入菌株染色體中?？衫猛庠粗亟M片段ermE*+lmbU兩端的引物PermE-F和LIN-4-R對突變菌的總DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。若是質(zhì)粒成功導(dǎo)入出發(fā)菌株，則會擴(kuò)增出大小約為1.66 kb的目標(biāo)條帶，而出發(fā)菌株S.lincolnensisN9則不會。PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示。

M.DNA Marker DL5000 1.突變菌LIN-DU的總DNA 2，3.出發(fā)菌S.lincolnensis N9的總DNA 4.突變菌LIN-U的總DNA

由圖5可知，PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)想的完全一致，突變菌LIN-DU中l(wèi)mbU基因內(nèi)部序列發(fā)生了缺失、突變菌LIN-U中成功倍增了lmbU基因，均可用于后續(xù)的發(fā)酵驗(yàn)證。

2.3 突變菌LIN-DU、LIN-U的發(fā)酵驗(yàn)證

對照菌N9、突變菌LIN-DU、LIN-U發(fā)酵液效價(jià)測定結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，對照菌N9的效價(jià)為3204 U·mL-1，突變菌LIN-DU、LIN-U的效價(jià)分別為100.30 U·mL-1、3219 U·mL-1。由于突變菌LIN-DU杯碟法測其效價(jià)非常低，又對其發(fā)酵液進(jìn)行了LC-MS測定，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，突變菌LIN-DU仍產(chǎn)生微量的林可霉素A(質(zhì)荷比為407)，但產(chǎn)量較出發(fā)菌株S.lincolnensisN9明顯下降，僅為出發(fā)菌株的1/30。

圖6 對照菌N9、突變菌LIN-DU、LIN-U發(fā)酵液效價(jià)測定結(jié)果

圖7 突變菌LIN-DU和對照菌S.lincolnensis N9 LC-MS圖譜對比

以上表型結(jié)果表明，lmbU為林可霉素生物合成的正調(diào)控基因，但單獨(dú)倍增lmbU基因?qū)τ诹挚擅顾禺a(chǎn)量和組分比例影響不顯著。

2.4 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，lmbU基因敲除能夠使S.lincolnensis野生菌株失去林可霉素生物合成能力，lmbU基因是林可霉素生物合成的關(guān)鍵基因[10]。作者通過序列分析，發(fā)現(xiàn)lmbU基因與幾種抗生素產(chǎn)生菌中調(diào)節(jié)基因具有很高的同源性。

本研究通過對lmbU基因的同框敲除，發(fā)現(xiàn)得到的突變菌的林可霉素產(chǎn)量明顯下降，LC-MS分析表明其仍能產(chǎn)生微量的林可霉素，證明lmbU基因是負(fù)責(zé)林可霉素生物合成的正調(diào)控基因。同時(shí)嘗試對lmbU基因進(jìn)行倍增以提高林可霉素的產(chǎn)量，結(jié)果表明得到的突變菌的林可霉素產(chǎn)量沒有明顯提高。可能lmbU基因并非是途徑特異性的調(diào)節(jié)基因，而是處于一個相對復(fù)雜的調(diào)控環(huán)境中，有待于進(jìn)一步探索和研究。

3 結(jié)論

研究了林可霉素生物合成基因簇中調(diào)控基因的功能。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pLIN-DU和pLIN-U分別對林可霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株Streptomyceslincolnensis的lmbU基因進(jìn)行同框敲除和基因倍增，獲得相應(yīng)突變菌LIN-DU和LIN-U后，對突變菌發(fā)酵液進(jìn)行生物效價(jià)測定和LC-MS分析，探討lmbU基因?qū)α挚擅顾禺a(chǎn)量和組分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因敲除突變菌LIN-DU的林可霉素生物合成能力大幅削弱；基因倍增突變菌LIN-U的林可霉素生物合成相對出發(fā)菌株沒有明顯變化。表明lmbU基因?qū)α挚擅顾厣锖铣删哂姓蛘{(diào)控作用。

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