房 瑋，周利明，趙樹(shù)堂，盧孟柱*

（1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000）

程序性細(xì)胞死亡（Programmed celldeath，PCD）也稱(chēng)細(xì)胞凋亡（Apoptosis），是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，更好地適應(yīng)生存環(huán)境而采取的一種由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)的、有序的死亡。植物和動(dòng)物在抗菌反應(yīng)過(guò)程中，經(jīng)常伴隨著PCD的產(chǎn)生[1]。大量研究表明，PCD對(duì)維持生物體正常生長(zhǎng)、發(fā)育等具有舉足輕重的作用。而線(xiàn)粒體所釋放的細(xì)胞色素c在PCD過(guò)程中起重要作用，在熱激誘導(dǎo)下的黃瓜子葉細(xì)胞編程性死亡[2]及D-甘露糖誘導(dǎo)的植物細(xì)胞編程性死亡[3]過(guò)程中都檢測(cè)到完整的線(xiàn)粒體中釋放出細(xì)胞色素c，Zhao等[4]采用胡蘿卜細(xì)胞來(lái)源的非細(xì)胞體系，在其中加入細(xì)胞色素c作為誘導(dǎo)劑，結(jié)果表明細(xì)胞色素c可以高效的誘導(dǎo)外源細(xì)胞核發(fā)生凋亡。在維生素K3誘導(dǎo)的原生質(zhì)體凋亡過(guò)程中，細(xì)胞色素c由線(xiàn)粒體釋放到胞漿[5]。細(xì)胞色素c的釋放可能是動(dòng)、植物細(xì)胞PCD過(guò)程中共同具有的保守事件。

DNase在PCD中起關(guān)鍵作用。植物細(xì)胞PCD的一個(gè)重要階段是DNA的降解（DNA片段化），DNA的片段化被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，具有不可逆性，其過(guò)程就是由DNase執(zhí)行的。在植物中，研究者們分別在胚的發(fā)育、花的發(fā)育、超敏反應(yīng)、環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的PCD、葉片衰老、糊粉層細(xì)胞的PCD和導(dǎo)管分子的分化等PCD研究中均觀察到了DNA的降解，同時(shí)也討論了相關(guān)核酸酶活性的情況[6～7]。

與 PCD相關(guān)的 DNase依據(jù)其活性的離子依賴(lài)型大致可分為以下兩大類(lèi)[8]：Zn2＋依賴(lài)型核酸內(nèi)切酶和 Ca2+依賴(lài)型核酸內(nèi)切酶，其中Ca2+依賴(lài)型核酸內(nèi)切酶在植物PCD的研究中報(bào)道文獻(xiàn)較少，王雅清等在杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）分化中的次生木質(zhì)部細(xì)胞中檢測(cè)到了Ca2+激活的DNase活性[9]。本實(shí)驗(yàn)室在毛白楊（Populus tomentosa）未成熟次生木質(zhì)部中同時(shí)檢測(cè)到DNA的片段化和DNase活性。這個(gè)DNase大小約為38KD，體外試驗(yàn)表明它可以降解單鏈和雙鏈DNA，其核酸酶活性依賴(lài)于Ca2+，并可被Mg2+、Zn2+所抑制。經(jīng)純化后通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定，從楊樹(shù)EST庫(kù)中獲得了相應(yīng)的基因序列，克隆了其編碼基因，將此蛋白定名為PtCDD，采用原核表達(dá)、DNA－SDS-PAGE膠內(nèi)分析等方法發(fā)現(xiàn)其編碼基因具有核酸酶活性，對(duì)該基因功能的研究將有助于我們對(duì)木質(zhì)部細(xì)胞程序性死亡機(jī)理的深入理解[10]。因此，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PtCDD的編碼基因——Ca2+依賴(lài)型DNase在楊樹(shù)形成層發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)與 PtCDD 蛋白相互作用的生物大分子進(jìn)行篩選，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

提取RNA所用植物材料為毛白楊（Populus tomentosa）剝皮后從樹(shù)皮內(nèi)表面所刮取的形成層和韌皮部區(qū)域，酵母雙雜交系統(tǒng)MatchMaker購(gòu)自Clontech公司，Qiagen植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit）購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，Marke、溶菌酶、DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，載體 pGEM-T Easy、T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Promega公司，IPTG、卡那霉素kmycin（Kna）、氨芐青霉素ampicillin（Amp）為Sigma公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京賽百勝生物技術(shù)公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 cDNA文庫(kù)的建立及誘餌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

參照Qiagen試劑盒說(shuō)明書(shū)提取楊樹(shù)形成層RNA，用MatchmakerTM Library Construction&Screening Kits構(gòu)建楊樹(shù)剝皮再生系統(tǒng)的pGADT7-cDNA文庫(kù)。

擴(kuò)增PtCDD全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 10 s，循環(huán)35次，最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)T4連接酶連入PGEM-T easy載體，后用EcoRI 和SalI雙酶切克隆載體和pGBKT7回收目的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-CDD轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單菌落培養(yǎng)提質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶方法鑒定篩選陽(yáng)性重組子，送北京奧科公司測(cè)序[11]。

1.3 誘餌蛋白的自激活性及毒性測(cè)試

[12－13]的方法，以酵母菌 Y187和 AH109為受體菌，采用 LiAc轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化陰性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-Lam、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-53、誘餌蛋白重組質(zhì)粒pGBKT7-PtCDD及空質(zhì)粒pGBKT7。將轉(zhuǎn)化的菌體分別涂布相應(yīng)SD/-His/Trp或SD/-Ade/-Trp平板，生長(zhǎng)2 ～ 3 d。

將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化空載體pGBKT7的AH109和Y187酵母細(xì)胞分別在SD/-Trp/Kan（50μg/mL）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 ～ 24 h，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值。

1.4 α-半乳糖苷酶活性檢測(cè)（顯色反應(yīng)）

在100 mm平皿底部加入2 mL含X-α-gal的Z buffer，加一張無(wú)菌的定性濾紙。在另一張滅菌的濾紙上做標(biāo)記，用鑷子夾住濾紙，讓濾紙一側(cè)先接觸DDO瓊脂平板上出現(xiàn)的AH109 酵母菌，并緩慢放到平板上，確保濾紙接觸平板上所有克隆，約1 min。用鑷子從一側(cè)揭起濾紙后夾住濾紙，克隆面向上在液氮中放10 s后取出融化，重復(fù)該步驟2 ～ 3次。將融化的濾紙克隆面向上放在被含X-gal的Z buffer浸濕了的濾紙上30℃培養(yǎng)3 h，觀察濾紙顏色變化。

1.5 酵母雙雜交及結(jié)果重新驗(yàn)證

按照Clontech公司Protocol說(shuō)明，用PEG/LiAc方法將pGBKT7-CDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109，將構(gòu)建的楊樹(shù)剝皮再生系統(tǒng)的pGADT7-cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y187酵母菌，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于SD/-His/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu瓊脂平板，30℃培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)，通常為3 ～ 8 d。挑取X-α-gal活性檢測(cè)過(guò)程中變藍(lán)的克隆，SD/-His/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基搖菌擴(kuò)增，按酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明提取混合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布Amp抗性的LB培養(yǎng)基。利用抗性篩選出pGADT7-cDNA質(zhì)粒，再用GAL4AD LD-Insert篩選引物Y2H5’和Y2H3’進(jìn)行酵母菌落PCR，結(jié)果送北京奧科公司測(cè)序。登錄www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行同源性分析。

將篩選得到的兩個(gè)片段AD1-10、AD12-2重新與載體PGADT7連接，得到重組質(zhì)粒后分別與pGBKT7-CDD共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，用共轉(zhuǎn)化的方法對(duì)兩個(gè)片段所產(chǎn)蛋白與PtCDD的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 凝膠阻滯試驗(yàn)

合成AD1-10片段，采用Pierce公司的DNA 3′End-Labeling System（生物素-11-UTP）進(jìn)行標(biāo)記后，將其與BSA、PtCDD蛋白在體外進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)體系為：5×binding buffer 4μL；0.45μg/μL BSA、PtCDD純化蛋白9μL；1M DTT 1μL；AD1-10探針1μL；H2O 4μL；冰上結(jié)合30 min，加3μL上樣緩沖液（含0.025%溴酚藍(lán)的無(wú)菌水），進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳分析。電泳1 h（200V）；用濾紙粘下膠，保鮮膜封好后，壓X光片1 ～ 2 h；洗片，顯影2 min，定影5 min[14]。

1.7 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR

根據(jù)Primer Express 3.0分別設(shè)計(jì)PtCDD編碼基因，AD1-10、AD12-2實(shí)時(shí)定量PCR所需引物。反應(yīng)體系參照TaKaRa SYBR PremixEx taqTM說(shuō)明書(shū)配制。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 誘餌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及序列測(cè)定

提取楊樹(shù)次生維管再生系統(tǒng)中形成層的總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到雙鏈cDNA（如圖1-A）。對(duì)PtCDD進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到編碼PtCDD基因的全長(zhǎng)片段。連入pGEMT-easy克隆載體，用EcoR I和Sal I 雙酶切克隆載體和誘餌質(zhì)粒pGBKT7回收目的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-PtCDD測(cè)序驗(yàn)證了所構(gòu)建載體的閱讀框架正確性，后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入AH109酵母菌株中，測(cè)序驗(yàn)證所構(gòu)建的載體閱讀框架正確性（如圖1-B、圖1-C）。

圖1 誘餌蛋白基因PtCDD的PCR擴(kuò)增及DNA-BD融合載體的構(gòu)建Figure 1 polymerase chain reaction amplification of PtCDD and construction of DNA-BD fusion vector

2.2 誘餌蛋白的自激活活性鑒定和毒性檢測(cè)

誘餌的蛋白本身不能具有轉(zhuǎn)錄激活活性，否則不能判斷是由于蛋白相互作用引起的報(bào)告基因的表達(dá)，還是由于誘餌蛋白自激活活性引起的報(bào)告基因的表達(dá)，所以在進(jìn)行文庫(kù)篩選之前，首先進(jìn)行了誘餌蛋白自激活活性鑒定。結(jié)果表明，含有pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGBKT7-PtCDD及空質(zhì)粒pGBKT7的轉(zhuǎn)化子在SD/-His/Trp或SD/-Ade/-Trp平板上不能生長(zhǎng)。這一結(jié)果表明pGBKT7-PtCDD誘餌蛋白沒(méi)有自激活活性，可以用于文庫(kù)篩選。

將轉(zhuǎn)化誘餌載體pGBKT7-PtCDD和轉(zhuǎn)化空載體pGBKT7的酵母細(xì)胞分別在SD/-Trp/Kan（20μg/mL）液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)16 ～ 24 h，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600發(fā)現(xiàn)，二者OD600比較接近且都大于0.8。這說(shuō)明誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞均沒(méi)有毒性，可以直接用于酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

用RNeasy Plant Mini Kit提取楊樹(shù)次生維管再生系統(tǒng)中形成層總RNA，用oligo（dT）作引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和LD-PCR擴(kuò)增得到雙鏈cDNA。將所得cDNA與載體PGADT7-Rec連接，得到楊樹(shù)形成層cDNA文庫(kù)，轉(zhuǎn)入Y187酵母菌株。經(jīng)公式計(jì)算，3μg pGADT7-lam的酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率為2.3×106，高于試劑盒所要求的1.0×106。另將對(duì)照的SV40 T PCR大片段與載體PGADT7-Rec連接作為對(duì)照。由對(duì)照的生長(zhǎng)情況可知轉(zhuǎn)入楊樹(shù)形成層cDNA文庫(kù)的Y187酵母菌株生長(zhǎng)情況符合要求。

2.4 酵母雙雜交篩選與PtCDD相互作用的片段

用 BD MatchmakerTMLibrary Construction & Screening Kits構(gòu)建鹽誘導(dǎo)楊樹(shù)形成層 cDNA文庫(kù)，以pGBKT7-PtCDD質(zhì)粒為誘餌蛋白，采用酵母共轉(zhuǎn)化方法篩選楊樹(shù)形成層 cDNA文庫(kù)。轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂布SD/-His/-Trp/-Leu/-Ade四缺培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 ～ 8 d，將長(zhǎng)出的酵母克隆轉(zhuǎn)接新的四缺平板上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 ～ 3 d長(zhǎng)出的較大菌落，進(jìn)行顯色反應(yīng)。在顯色反應(yīng)之后真正的陽(yáng)性克隆能激活報(bào)告基因MeL1，編碼α-半乳糖苷酶，分解底物X-α-Gal產(chǎn)生藍(lán)色，而不能生長(zhǎng)或不能呈現(xiàn)藍(lán)色的克隆可能為假陽(yáng)性克隆。經(jīng)顯色反應(yīng)可以很快變藍(lán)的菌落可初步判斷為陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)初篩，共得到了64個(gè)陽(yáng)性克隆。

用GAL4AD LD-Insert篩選引物Y2H5’和Y2H3’進(jìn)行酵母菌落PCR，對(duì)得到的64個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行二次篩選，發(fā)現(xiàn)插入的片段大小從300 ～ 400 bp不等，并且有的陽(yáng)性克隆包含有多條帶。根據(jù)PCR篩選結(jié)果，從中挑取帶形清晰、亮度高、片段較大的38個(gè)酵母陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂布Amp+平板，從每個(gè)平板上挑取若干克隆，進(jìn)行菌液PCR篩選并送出測(cè)序（圖3）。

圖2 cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)入Y187酵母菌株的生長(zhǎng)情況Figure 2 Tthe growth of the yeast strain Y187 after cDNA library was transformated

圖3 PCR對(duì)陽(yáng)性克隆文庫(kù)進(jìn)行二次篩選示意圖Figure 3 The diagram of screening Positive clones by PCR

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，登錄www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行同源性分析，得到了有較高研究?jī)r(jià)值的2個(gè)克隆，AD1-10和AD12-2分別為銀樺線(xiàn)粒體的核糖體RNA小亞基基因（mtSSU）（GenBank：AF193995）和楊樹(shù)葉片在干旱脅迫條件下得到的一種EST（GenBank：CU23122）。

將篩選得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒分別與誘餌載體pGBKT7-PtCDD共轉(zhuǎn)化酵母AH109，在SD/-His/-Trp/-Leu/-Ade平板上觀察菌斑生長(zhǎng)情況。另外用這2個(gè)質(zhì)粒分別與陰性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-Lam共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109作為對(duì)照，在SD/-Leu/-His/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒定（圖4）。

圖4 重新驗(yàn)證及假陽(yáng)性克隆的排除Figure 4 Re-verification and elimination of flase Positive clones

圖5 片段AD1-10與PtCDD蛋白的體外結(jié)合Figure 5 Combination of AD1-10 and PtCDD protein

2.5 凝膠阻滯驗(yàn)證PtCDD蛋白與AD1-10的結(jié)合

PtCDD屬于Ca2+依賴(lài)型DNase，具有與DNA結(jié)合的特性，在前面的實(shí)驗(yàn)中，已證明PtCDD在酵母細(xì)胞內(nèi)能結(jié)合MtSSU片段AD1-10的功能。為此，合成了AD1-10片段，用（生物素-11-UTP）標(biāo)記作為探針。將其與BSA、PtCDD蛋白在體外進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，非變性PAGE膠電泳ZH轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行生物素的檢測(cè)。放射自顯影結(jié)果表明，PtCDD與AD1-10探針具有結(jié)合功能，電泳條帶被阻滯，BSA不具有AD1-10探針的結(jié)合功能，因此電泳條帶沒(méi)有被阻滯（圖5）。通過(guò)Light shift EMSA實(shí)驗(yàn)，體外驗(yàn)證了PtCDD蛋白與mtSSU片段AD1-10的結(jié)合。

3 討論

木材的形成過(guò)程包括形成層木質(zhì)部側(cè)的母細(xì)胞分裂、細(xì)胞的延伸擴(kuò)展（衍生細(xì)胞不斷伸長(zhǎng)直至其最終大小的伸長(zhǎng)區(qū)）、次生細(xì)胞壁的沉積、木質(zhì)化和伴隨木質(zhì)化和細(xì)胞壁次生加厚的細(xì)胞程序性死亡（PCD）。DNase在PCD中起關(guān)鍵作用[15,16]，目前，植物PCD過(guò)程當(dāng)中DNase與線(xiàn)粒體的具體作用機(jī)制還不是十分清楚，本實(shí)驗(yàn)以pGBKT7-PtCDD為誘餌質(zhì)粒在楊樹(shù)形成層cDNA文庫(kù)中進(jìn)行篩選，得到的AD1-10、AD12-2片段。經(jīng)GenBank分析后發(fā)現(xiàn)，編碼AD1-10的基因?yàn)殂y樺線(xiàn)粒體的核糖體RNA小亞基基因（mtSSU）（GenBank：AF193995），編碼AD12-2為楊樹(shù)葉片在干旱脅迫條件下得到的一種EST，功能未知（GenBank：CU231222）。

本實(shí)驗(yàn)中所篩選到得AD1-10為mtSSU基因片段，mtSSU線(xiàn)粒體的核糖體RNA小亞基基因，所以本研究又進(jìn)行了凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，體外驗(yàn)證了PtCDD蛋白與mtSSU片段AD1-10的結(jié)合。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知PtCDD可能在楊樹(shù)體內(nèi)與線(xiàn)粒體的核糖體基因結(jié)合。

線(xiàn)粒體在植物細(xì)胞程序化死亡過(guò)程中起著非常重要的作用。植物細(xì)胞中存在線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道（PT pore），植物細(xì)胞究竟是存活、程序性死亡還是壞死都受控于線(xiàn)粒體通道的開(kāi)放程度。線(xiàn)粒體內(nèi)部凋亡性因子的釋放、膜電位的改變、氧活性的產(chǎn)生、電子傳遞鏈的破壞、ATP合成量的減少都參與并且可能影響細(xì)胞死亡的不同形式，因此可以認(rèn)為線(xiàn)粒體是細(xì)胞存活或者死亡的中心調(diào)節(jié)因子[1]。而 PtCDD是一種 Ca2+依賴(lài)性的DNase，具有DNA的結(jié)合活性，在Ca2+完全可能直接與DNA結(jié)合。由此PtCDD直接在楊樹(shù)體內(nèi)與線(xiàn)粒體的基因結(jié)合的話(huà)，便可能影響整個(gè)PCD的過(guò)程，而具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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