LPS誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Panc－1表達(dá)B7－H1*

馬 君，黃東勝，金洪傳，劉軍偉，沈國(guó)梁，汪 帆

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院1普外科，2浙江省生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3生物醫(yī)學(xué)研究中心，浙江 杭州 310016)

胰腺癌是一種極度惡性的消化道腫瘤，具有高度的侵襲性，對(duì)放化療均不敏感，發(fā)病率接近于死亡率。目前，根治性手術(shù)切除是治療胰腺癌最有效的手段，但由于早期癥狀隱匿不易診斷而易喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，且腫瘤在早期就易侵犯周圍組織并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后很差，術(shù)后5年生存率僅為8% ～10%［1］。因此，積極探索胰腺癌的治療方法具有重要的臨床意義。近年來腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的B7－H1分子和 Toll樣受體(Toll－like receptors，TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系倍受關(guān)注。B7－H1是Dong等［2］從人類基因庫(kù)搜索B7同源分子時(shí)在胎盤cDNA文庫(kù)中確認(rèn)的，它編碼一個(gè)290個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，表達(dá)于靜息的T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，同時(shí)也表達(dá)于絕大多數(shù)的腫瘤組織中。B7－H1可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，從而參與腫瘤的免疫逃逸過程［3－4］。TLRs是新發(fā)現(xiàn)的先天性免疫的病原識(shí)別受體，其中TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR，主要配體為革蘭陰性桿菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，TLR4的活化可激活一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)家族，很多研究表明TLR4被活化后可使腫瘤細(xì)胞逃避人體的免疫監(jiān)視［5］。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激可以上調(diào)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1中B7－H1的表達(dá)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase，p38)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal－regulated kinases，ERK)的活化在LPS誘導(dǎo)B7－H1的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過探討B(tài)7－H1表達(dá)的分子機(jī)制，為胰腺癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco;LPS(E.coli O111∶B4)、SB203580(p38 的抑制劑)、PD98059(ERK的抑制劑)和SP600125［c－Jun氨基端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)的抑制劑］均購(gòu)于Sigma;p－ERK、ERK、p－JNK、JNK、p－p38的單克隆抗體和p38的多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling;PE標(biāo)記的抗人TLR4單克隆抗體以及它的同型對(duì)照抗體購(gòu)自eBioscience;鼠抗人B7－H1單克隆抗體購(gòu)自R＆D;Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen;M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Promega;SYBR Green I購(gòu)自TaKaRa;RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司;B7－H1和GAPDH引物序列由上海Invitrogen合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株 Panc－1用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。細(xì)胞在培養(yǎng)12h后再加入LPS或是各種抑制劑。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4在人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1上的表達(dá) 將Panc－1細(xì)胞以4.0×105/well的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞。1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×1010/L，加入5 μL PE標(biāo)記的CD284抗體(鼠IgG2a抗體作為同型對(duì)照)，4℃避光孵化30 min。加入2 mL 1×PBS，400 r/min 4℃離心5 min，洗2遍。500 μL 1×PBS重懸細(xì)胞后用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用BD CellQuest軟件分析。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Panc－1細(xì)胞B7－H1 mRNA的表達(dá) 將Panc－1細(xì)胞以4.0×105/well的密度接種于6孔板中，共鋪3組，培養(yǎng)12 h后分別做如下處理:第1組加入LPS使其終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 mg/L后繼續(xù)培養(yǎng)4 h;第2組加入終濃度為1.0 mg/L的LPS后分別繼續(xù)培養(yǎng)0、2、4和8 h;第3組1孔不做任何處理，另1孔加入1.0 mg/L LPS，其余孔分別用20μmol/L SB203580、20 μmol/L PD98059和10 μmol/L SP600125預(yù)處理2 h，加入1 mg/L LPS繼續(xù)培養(yǎng)4 h。消化收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，并用NanoDrop2000C分光光度計(jì)測(cè)定濃度。取0.5μg總RNA，按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的操作步驟制備cDNA。根據(jù)TaKaRa熒光定量PCR試劑盒提供的操作步驟，以GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行real－time PCR反應(yīng)，所用的引物序列如下:B7－H1上游引物序列5'－GGTGCCGACTACAAGCGAAT－3'，下游引物序列 5'－GGTGACTGGATCCACAACCAA－3';GAPDH上游引物序列5'－ACGGATTTGGTCGTATTGGG－3'，下游引物序列5'－CCTGGAAGATGGTGATGGGATT－3'。結(jié)果用 ABI Prism 7500 real－time PCR System進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4遍。

2.4 Western blotting檢測(cè) Panc－1細(xì)胞中 p－p38、p－ERK、p－JNK和 B7－H1的表達(dá) Panc－1細(xì)胞以4.0×105/well的密度接種于6孔板中，共接種5組，培養(yǎng)12 h后各組做如下處理:第1組加入LPS使其終濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0 mg/L 培養(yǎng) 24 h;第2組以1.0 mg/L LPS分別培養(yǎng)0、12、24和36 h;第3組加入 1.0 mg/L LPS，分別培養(yǎng) 0、15、30、60 和90 min;第4、5組1孔不做任何處理，另1孔加入1.0 mg/L LPS，其余孔分別用 20 μmol/L SB203580、20 μmol/L PD203580和10 μmol/L SP600125預(yù)處理2 h，其中第4組加入1.0 mg/L LPS分別繼續(xù)培養(yǎng)15、30、60 min，而第5組加入1.0 mg/L LPS培養(yǎng)24 h。消化收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，10%的分離膠分離蛋白后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用特異性的抗體去檢測(cè)第1、2、5組中B7－H1的表達(dá)以及第3、4組中 p－p38、p－ERK和p－JNK的變化，以 GAPDH和總的p38，ERK、JNK作為標(biāo)準(zhǔn)參照。結(jié)果用LAS－4000－Mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 LPS誘導(dǎo)Pcnc－1細(xì)胞中B7－H1的表達(dá)上調(diào)

通過LPS刺激Panc－1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，LPS可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1中B7－H1的表達(dá)。如圖1所示，B7－H1 mRNA表達(dá)水平在LPS刺激后明顯上調(diào)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，隨著LPS濃度的增加，B7－H1的表達(dá)水平也逐漸升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，且當(dāng)LPS濃度為1.0 mg/L時(shí)，其表達(dá)出現(xiàn)最高峰，見圖1A。為了驗(yàn)證 B7－H1 mRNA表達(dá)的時(shí)間依賴性，我們用1.0 mg/L LPS處理Panc－1細(xì)胞不同的時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B7－H1 mRNA也呈現(xiàn)明顯的時(shí)間梯度，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，B7－H1 mRNA的表達(dá)水平也逐漸升高，且在4h的時(shí)侯其表達(dá)水平最高，見圖1B。與此同時(shí)我們用Western blotting也證實(shí)了B7－H1在蛋白水平上的表達(dá)也具有相應(yīng)的濃度和時(shí)間依賴性，其在LPS濃度為1.0 mg/L，刺激時(shí)間為24 h的時(shí)侯表達(dá)水平最高，見圖1C、D。以上結(jié)果表明在胰腺癌細(xì)胞中LPS能顯著上調(diào)B7－H1的表達(dá)，并具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。

Figure 1.LPS induced up－regulation of the expression of B7－H1 in Panc－1 cells.Dose－dependent(A and C)and time－dependent(B and D)mRNA(A and B)and protein(C and D)expression of B7－H1 was observed in Panc－1 cells following LPS stimulation..n=4.*P＜0.05 vs 0 mg/L or 0 h.圖1 LPS誘導(dǎo)Panc－1細(xì)胞中B7－H1的表達(dá)上調(diào)

2 LPS刺激后可以活化Panc－1細(xì)胞中MAPKs信號(hào)通路

結(jié)果顯示，TLR4表達(dá)于Panc－1細(xì)胞上，見圖2A。LPS刺激后，p－p38、p－ERK和 p－JNK的表達(dá)水平隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并分別在15、30、60 min時(shí)達(dá)到最高峰，見圖2B－D，這表明在胰腺癌細(xì)胞中LPS可以活化MAPKs信號(hào)通路。

Figure 2.LPS activated MAPKs pathway.A:TLR4 expression on Panc－1 cells，the grey line indicates staining with unrelated isotype－matched control antibody.LPS induced the phosphorlation of p38(B)，ERK(C)and JNK(D)..n=4.*P＜0.05 vs 0 min.圖2 LPS活化MAPKs通路

3 MAPKs信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)Panc－1細(xì)胞表達(dá)B7－H1的過程中起著重要作用

3種抑制劑的抑制效果如圖3所示:當(dāng)SB203580、PD98059和 SP600125的濃度分別為20 μmol/L、20 μmol/L 和 10 μmol/L 時(shí)可以顯著下調(diào)p38、ERK和JNK的磷酸化水平。抑制p38或ERK都能顯著下調(diào)由LPS誘導(dǎo)的B7－H1的表達(dá)(P＜0.05);抑制JNK的活化在LPS誘導(dǎo)的B7－H1表達(dá)中沒有明顯作用(P＞0.05)，見圖4。

討 論

胰腺的原發(fā)性腫瘤主要來源于3種組織:胰腺外分泌、內(nèi)分泌和間葉組織，而在所有的胰腺癌中，導(dǎo)管腺癌占胰腺癌的80% ～90%，因此我們選用來源于導(dǎo)管細(xì)胞的人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1來研究LPS通過活化TLR4－MAPKs信號(hào)通路誘導(dǎo)B7－H1表達(dá)的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激Panc－1細(xì)胞后可上調(diào)B7－H1的表達(dá)，且呈一定的濃度和時(shí)間相關(guān)性。同時(shí)我們用p38、ERK及JNK的特異性抑制劑來研究它們磷酸化水平的變化與B7－H1表達(dá)水平的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的B7－H1表達(dá)可受p38和ERK磷酸化水平變化的調(diào)節(jié)，而與JNK磷酸化水平的變化沒有明顯的相關(guān)性。

LPS與 TLR4結(jié)合后活化 MAPKs信號(hào)通路，MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，它受到刺激后磷酸化而活化，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中都起著重要作用，它包括多個(gè)亞族，其中p38、ERK和JNK是最主要的3條信號(hào)途徑［6］。我們的研究表明LPS刺激胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1后，p38、ERK和JNK磷酸化水平呈時(shí)間依賴性顯著上調(diào)。之前已有報(bào)道證實(shí)干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor－1，IRF －1)和兩面神激酶(Janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)通路在干擾素 －γ(interferon－γ，INF－γ)誘導(dǎo)B7－H1的表達(dá)過程中起著重要作用［7］。但關(guān)于LPS誘導(dǎo)B7－H1表達(dá)的機(jī)制尚沒有相關(guān)的研究報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激能使p38、ERK和JNK的磷酸化水平都顯著升高，但只有p38和ERK的活化與B7－H1的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，而JNK的磷酸化水平變化與B7－H1的表達(dá)關(guān)系不大。進(jìn)一步研究JNK活化參與的調(diào)控機(jī)制將很有意義。我們的實(shí)驗(yàn)第一次證實(shí)了在人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc－1上，LPS可能通過活化p38和ERK來調(diào)控B7－H1的表達(dá)。

Figure 3.Inhibition of LPS－induced phosphorylation with specific inhibitors of MAPKs.A:p38 inhibitor;B:ERK inhibitor;C:JNK inhibitor..n=4.*P＜0.05 vs LPS.圖3 特異性抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)活化MAPKs通路的影響

Figure 4.p38 and ERK were involved in LPS－induced B7－H1 expression.A－C:mRNA expression;D－F:protein expression.A，D:p38 inhibitor;B，E:ERK inhibitor;C，F(xiàn):JNK inhibitor..n=4.*P＜0.05 vs LPS.圖4 p38和ERK對(duì)LPS誘導(dǎo)B7－H1 mRNA和蛋白的表達(dá)的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)B7－H1通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡抑制腫瘤免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。B7－H1阻斷可增強(qiáng)單核細(xì)胞來源的未成熟樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)的免疫刺激活性，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖的能力［8］。在胰腺癌小鼠模型中用特異性抗體阻斷B7－H1的表達(dá)能顯著抑制腫瘤的進(jìn)展，同時(shí)上調(diào)INF－γ及下調(diào)白細(xì)胞介素－10(interleukin－10，IL－10)的表達(dá)，且與治療胰腺癌的化療藥物吉西他濱聯(lián)合使用有協(xié)同作用［9］。Gong等［10］證實(shí)在膽管上皮中miRNA－513參與了B7－H1的翻譯調(diào)控。而我們的實(shí)驗(yàn)首次在人胰腺癌Panc－1細(xì)胞株中證實(shí)，p38和ERK可調(diào)控B7－H1的表達(dá)。至于在人胰腺癌Panc－1細(xì)胞株中是否也存在miRNA對(duì)B7－H1表達(dá)調(diào)控目前尚不清楚，LPS的作用能否調(diào)控相關(guān)miRNA的水平也很值得進(jìn)一步探索。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株(MC26)、乳腺癌細(xì)胞株(4T1)、前列腺癌細(xì)胞株(RM1)、黑色素瘤細(xì)胞株(B16)以及肺癌細(xì)胞株(LLC1)表面均表達(dá)TLR4。盡管對(duì)于在腫瘤上存在何種TLR4配體我們還不是很了解，但近來的研究顯示包括LPS在內(nèi)的如紫杉醇、熱休克蛋白60(heat－shock protein 60，HSP60)、HSP70、呼吸道合胞病毒的融合蛋白以及鼠乳腺腫瘤病毒的包膜蛋白均能活化 TLR4［11］。用LPS刺激MC26，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液能夠顯著抑制T細(xì)胞的增殖及NK細(xì)胞的活化，從而使腫瘤逃避免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)加速。另外，Kelly等［12］發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)于人卵巢癌上皮細(xì)胞表面，被LPS激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，他們提出腫瘤細(xì)胞可通過TLRs調(diào)控腫瘤微環(huán)境并影響免疫細(xì)胞的活性。B7－H1正是在腫瘤的免疫逃逸過程中發(fā)揮著重要作用的分子，另有研究表明在小膠質(zhì)細(xì)胞以及U937細(xì)胞(人巨噬細(xì)胞系)中，LPS刺激均能使B7－H1的表達(dá)上調(diào)。這些研究使我們把TLR4的活化和B7－H1的表達(dá)聯(lián)系起來，通過TLR4這一中介進(jìn)一步去研究胰腺癌細(xì)胞中B7－H1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。而我們的研究也恰好證實(shí)了我們的猜想。另外，TLR4的活化還可以激活磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［13］，而對(duì)于PI3K信號(hào)的激活與B7－H1的表達(dá)之間是否存在某種關(guān)聯(lián)尚需要進(jìn)一步研究。

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