靶向PERK基因的shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下L02肝細(xì)胞凋亡的影響*

曹 潔，楊朝霞△，沈 薇△，姚 隆

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科，重慶 400010;2江津區(qū)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 402260)

PERK［RNA－dependent protein kinase(PKR)－like endoplasmic reticulum kinase］是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅰ型跨膜蛋白，N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，非應(yīng)激時(shí)與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose－regulated protein，GRP)78形成復(fù)合物，C端位于胞質(zhì)，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)狀態(tài)下，PERK與GRP78解離，發(fā)生自身聯(lián)合，自身磷酸化而激活，激活的PERK磷酸化真核翻譯起始因子－2的α亞基(eIF2－α)51位的絲氨酸，從而阻斷蛋白合成，降低了去往內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量，最終減輕了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)，但是磷酸化的eIF2－α卻可以選擇性增加活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)mRNA的表達(dá)，繼而上調(diào)促凋亡因子CHOP的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］。已有研究證實(shí)，在ERS狀態(tài)下，PERK基因在鼠 INS－1細(xì)胞［2］和鼠H4IIE細(xì)胞［3］凋亡的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，但是有關(guān)PERK基因與ERS狀態(tài)下人肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系鮮有報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建靶向人PERK基因的短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞株 L02，沉默PERK基因，同時(shí)用毒胡蘿卜素(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵抑制劑，thapsigargin，TG)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS反應(yīng)，觀察肝細(xì)胞凋亡的變化，旨在為進(jìn)一步研究PERK基因及其相關(guān)的信號(hào)通路在ERS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用和機(jī)制打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 質(zhì)粒和菌株 pGenesil－1.1質(zhì)粒載體購(gòu)自武漢晶賽生物技術(shù)公司，大腸桿菌E.coli DH5α由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬二院肝病研究所提供。

1.2 細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞由本消化科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要試劑 T4 DNA連接酶、DNA Fragment Purification Kit.2.0 試劑盒、MiniBEST Plasmid Purification Kit.2.0 試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa);Poly JetTM轉(zhuǎn)染試劑(SignaGen);RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物公司);兔抗PERK多克隆抗體(Santa Cruz);PCR引物由大連TaKaRa公司合成;MIT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Annexin V－PE/7－AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物有限公司)。

2 方法

2.1 shRNA真核表達(dá)載體序列的設(shè)計(jì) 根據(jù)Gen-Bank提供的人PERK基因序列(NM－004836)，利用Ambion公司的在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.Ambion.com)，并參考哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞siRNA的TuschlAA－19nt設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)人PERK基因mRNA的靶位點(diǎn)序列，包括3個(gè)特異匹配位點(diǎn)和1個(gè)隨機(jī)錯(cuò)配的寡核苷酸片段。根據(jù)載體特性，合成發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列。BLAST檢索設(shè)計(jì)的DNA片段序列的特異性，排除陰性對(duì)照序列與人體其它任何mRNA有同源性。序列由武漢晶賽生物技術(shù)公司合成。shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA的結(jié)構(gòu)模式為:CACC+正義序列+莖環(huán)序列+反義序列+終止信號(hào)+SacⅠ酶切位點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄模板DNA序列如下:PERK1－1.1－A:5'－CACC GCTTTGGAATCTGTCACTAATTTCAAGACGATT AGTGACAGATTCCAAAGCTTTTTTG－3';PERK1－1.1－B:5'－AGCTCAAAAAAGCTTTGGAATCTGTCACTAATCGTCTTGAAATTAGTGACAGATTCCAAAGC－3';PERK2－1.1－A:5'－CACCGCCTCAAGCCATCCAACATATTCTATGGACAAATATGTTGGATGGCTTGAGGTTTTTTG－3';PERK2－1.1－B:5'－AGCTCAAAAAACCTCAAGCCATCCAACATATTTGTCCATAGAATATGTTG-GATGGCTTGAGGC －3';PERK3－1.1－A:5'－CACCGTTGTGCTAGCAACCCTAATATTCAAGACGTATTA-GGGTTGCTAGCACAACTTTTTTG－3';PERK3－1.1－B:5'－AGCTCAAAAAAGTTGTGCTAGCAACCCTAATACGTCTTGAATATTAGGGTTGCTAGCACAAC－3';HK －1.1－A:5'－CACCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTG－3';HK －1.1－B:5'－AGCTCAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTC －3'。

2.2 shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述shRNA序列的模板DNA正、反義鏈退火后合成DNA片段。質(zhì)粒pGenesil－1.1經(jīng)Eco31I酶切，形成線性片段，并加以純化。稀釋退火片段分別與線性化pGenesil－1.1質(zhì)粒表達(dá)載體連接。連接反應(yīng)條件:稀釋退火片段 1 μL;線性化質(zhì)粒載體 1 μL;10×ligase buffer 1 μL;T4 DNA 連接酶 1 μL;ddH2O 6 μL，37 ℃ 水浴反應(yīng)過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，篩選卡那霉素抗性克隆，挑取陽(yáng)性克隆，用小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒分別經(jīng)Sac I做酶切鑒定，在酶切鑒定中觀察到所插入的小片段后，取轉(zhuǎn)化菌液送武漢晶賽公司測(cè)序。證實(shí)序列正確后，分別命名為PERK1－shRNA、PERK2－shRNA、PERK3－shRNA及陰性對(duì)照HK－shRNA。大量擴(kuò)增菌株，抽提質(zhì)粒，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞后綠色熒光信號(hào)觀察 L02細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基(含雙抗:青霉素0.0625 g/L，鏈霉素0.1 g/L)，37℃、5%CO2、飽和濕度傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組:即未做任何處理;陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染HK－shRNA;實(shí)驗(yàn)組:分別轉(zhuǎn)染 PERK1－shRNA、PERK2－shRNA和PERK3－shRNA。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×108/L細(xì)胞密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)70% ～80%時(shí)，將1 μg干擾質(zhì)粒和3 μL Poly JetTM轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染12～18 h后，培養(yǎng)液更換為完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染24、48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表達(dá)情況。

2.4 RT－PCR法檢測(cè)PERK mRNA的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)純度及完整性，按TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)方法逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，Quantity One 4.52圖像分析軟件半定量分析，以PERK與β－actin的比值代表其相對(duì)含量。PERK上游引物5'－AGCACTCAGATGGAGAGAGTCAG －3'，下游引物5'－GCTATGGGAGTTGTTGGACTGT －3'，產(chǎn)物大小260 bp;β－actin上游引物5'－GACCCAGATCATGTTTGAGACC－3'，下游引物 5'－ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG －3'，產(chǎn)物大小550 bp。

2.5 Western blotting檢測(cè)PERK蛋白的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，按總蛋白提取試劑盒說(shuō)明步驟提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，分裝后－80℃保存，避免反復(fù)凍融。蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入兔抗PERK多克隆抗體(1∶500稀釋)，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5000稀釋)，ECL顯影。以β－actin為內(nèi)參照。Quntity One 4.52圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，將每個(gè)樣本的積分吸光度值與β－actin的積分吸光度值相比，得出的比值代表其蛋白相對(duì)含量。

2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 L02細(xì)胞以5×107/L的細(xì)胞濃度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，按2.3方法將上述篩選出的最佳干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞，分組如下:(1)正常細(xì)胞組(normal組);(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型組(TG組):即毒胡蘿卜素刺激L02細(xì)胞;(3)轉(zhuǎn)染HK－shRNA載體的肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型組(HK+TG組);(4)轉(zhuǎn)染PERK－shRNA載體的肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型組(PERK+TG組)。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，加入終濃度為100 nmol/L［4］毒胡蘿卜素，孵育24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)3次。

2.7 Annexin V－PE/7－AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按2.6方法處理細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，用1 μL Annexin V －PE 和5 μL 7－AAD避光染色10 min后，將細(xì)胞置激發(fā)光為488 nm波長(zhǎng)的FACS Calibur型流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，上機(jī)測(cè)定時(shí)獲取2×105個(gè)以上細(xì)胞，重復(fù)3次。得到的數(shù)據(jù)用ModFit LT軟件分析結(jié)果。染色后將細(xì)胞分為3個(gè)亞群:活細(xì)胞胞膜完整，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)無(wú)外化，為 Annexin V －PE－/7－AAD－亞群;早期凋亡細(xì)胞胞膜完整，PS外化，為Annexin V－PE+/7－AAD－亞群;晚期凋亡或壞死細(xì)胞胞膜不完整，PS外化，為Annexin V－PE+/－7AAD+亞群。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建、電泳鑒定及測(cè)序

經(jīng)BLAST檢索，證實(shí)設(shè)計(jì)好的DNA片段序列僅與PERK基因有同源性，且有明顯的特異性，陰性對(duì)照DNA片段與人任何基因無(wú)同源性，可用于shRNA的構(gòu)建。

重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Sac I單酶切得到一條約916 bp的DNA小帶，初步表明4個(gè)重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。隨后測(cè)序結(jié)果顯示，僅PERK2－shRNA的loop環(huán)上有3個(gè)堿基與初始設(shè)計(jì)不符，但依據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，不會(huì)影響干擾實(shí)驗(yàn)，其余3個(gè)重組質(zhì)粒中的目的序列與設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列完全一致，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

Figure 1.Digestion and identification of recombinant plasmids.1:PERK1－shRNA;2:PERK2－shRNA;3:PERK3－shRNA;4:HK －shRNA;5:marker.圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Figure 2.The sequences of recombinant plasmids.A:PERK1－shRNA;B:PERK2－shRNA;C:PERK3－shRNA;D:HK－shRNA.圖2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2 shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染L02肝細(xì)胞后EGFP的表達(dá)

構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒攜帶有EGFP(顯示綠色熒光)報(bào)告基因，經(jīng)Poly JetTM轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48 h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染各質(zhì)粒的細(xì)胞帶綠色熒光，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞則未出現(xiàn)熒光，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Expression of EGFP in L02 cells after transfected with recombinant plasmids for 24 h(×200).A:PERK1－shRNA;B:PERK2－shRNA;C:PERK3－shRNA;D:HK－shRNA.圖3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h后L02細(xì)胞中EGFP的表達(dá)

3 RT－PCR檢測(cè)shRNA對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)PERK mRNA表達(dá)

不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，RT－PCR檢測(cè)結(jié)果表明各組樣本均可見(jiàn)亮度均一的β－actin對(duì)照條帶，應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組(PERK1、PERK2、PERK3)mRNA相對(duì)表達(dá)量(PERK/β－actin)分別為0.24±0.01、0.23±0.03、0.10±0.07、0.17±0.05、0.21±0.02，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)顯著(P＞0.05)，各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較差異均顯著(P＜0.05)，并且以PERK1－shRNA的差異最為顯著，見(jiàn)圖4。

Figure 4.RT－PCR analysis of PERK mRNA in L02 cells.1:marker;2:control;3:HK－shRNA;4:PERK1－shRNA;5:PERK2－shRNA;6:PERK3－shRNA.圖4 RT－PCR法檢測(cè)shRNA對(duì)L02細(xì)胞中PERK mRNA表達(dá)的影響

4 Western blotting檢測(cè)shRNA對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)PERK蛋白表達(dá)的影響

不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組的蛋白相對(duì)含量(PERK/β－actin)分別為 0.29±0.07、0.30±0.02、0.17±0.03、0.22±0.01、0.26±0.04，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)顯著(P＞0.05)，各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較差異均顯著(P＜0.05)，但是 PERK1－shRNA對(duì)PERK蛋白表達(dá)的抑制作用最明顯，結(jié)合RT－PCR結(jié)果，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用重組質(zhì)粒PERK1－shRNA進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Western blotting analysis of PERK protein in L02 cells.1:control;2:HK－shRNA;3:PERK1－shRNA;4:PERK2－shRNA;5:PERK3－shRNA.圖5 Western blotting法檢測(cè)shRNA對(duì)L02細(xì)胞中PERK蛋白表達(dá)的影響

5 PERK1－shRNA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下L02細(xì)胞活力的影響

經(jīng)100 nmol/L毒胡蘿卜素誘導(dǎo)各組L02細(xì)胞24 h后，MTT測(cè)定結(jié)果表明，在ERS狀態(tài)下，與正常細(xì)胞組相比，肝細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染PERK1－shRNA能明顯增加肝細(xì)胞的活力，且差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 6.The cell viability of each group.The figure showed that endoplasmic reticulum stress induced by thapsigargin(TG)could decrease the cell viability，while such effect was inhibited by PERK1－shRNA transfection..n=3.*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs TG group.圖6 MTT法檢測(cè)PERK－shRNA對(duì)ERS狀態(tài)下L02細(xì)胞活力的影響

6 PERK1－shRNA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下L02細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V－PE/7－AAD流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果證實(shí)，ERS能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，而沉默PERK基因能夠有效的抑制ERS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡(P ＜0.05)，見(jiàn)圖7。

Figure 7.The apoptotic rate of each group.Representative graphs were obtained by flow cytometry analytic after double staining with Annexin V－PE and 7－AAD.The figure showed that endoplasmic reticulum stress could increase the apoptotic rate of L02 cells，while such effect was attenuated by PERK1－shRNA transfection..n=3.*P＜0.05 vs normal group;▲P＜0.05 vs TG group.圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PERK－shRNA對(duì)ERS狀態(tài)下L02細(xì)胞凋亡的影響

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞器，含多種酶系統(tǒng)，參與脂類代謝過(guò)程。多種生理或病理?xiàng)l件會(huì)引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在ER聚集，損傷ER的正常生理功能，稱為ERS［5］。許多文獻(xiàn)報(bào)道ERS與酒精性肝病、糖尿病、神經(jīng)元變形等疾病有關(guān)［6］。PERK是位于ER膜上的3種跨膜蛋白之一，配體結(jié)合域位于ER腔面，效應(yīng)域位于ER胞質(zhì)面，在ERS早期，PERK信號(hào)通路通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的合成對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用、促進(jìn)細(xì)胞生存，隨著ERS時(shí)間的延長(zhǎng)，PERK通過(guò)誘導(dǎo)促凋亡因子CHOP的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［1］。越來(lái)越多的研究證實(shí)肝細(xì)胞凋亡是造成肝臟損傷和肝臟疾病最基本的中心環(huán)節(jié)［7］。因此，本研究選擇構(gòu)建了靶向PERK基因的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，觀察PERK基因的缺失對(duì)ERS條件下肝細(xì)胞凋亡的影響。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過(guò)程。細(xì)胞中特異性核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21－25個(gè)核苷酸組成的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，隨后 siRNA通過(guò)識(shí)別與之序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA使特定基因在轉(zhuǎn)錄后水平被降解從而下調(diào)靶基因表達(dá)［8－10］。2001年，Elbashir等［11］首次發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞也存在RNAi現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了RNAi技術(shù)在疾病治療領(lǐng)域的研究和應(yīng)用，同時(shí)也為RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗腫瘤等的研究奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選用武漢晶賽生物技術(shù)公司的pGenesil－1.1質(zhì)粒載體，該載體含有人RNA聚合酶Ⅲ家族的hU6啟動(dòng)子，RNA聚合酶Ⅲ識(shí)別的終止信號(hào)3'端6個(gè)連續(xù)的T，可指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄出3'端突出包含莖環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時(shí)該載體含有報(bào)告基因EGFP和抗生素標(biāo)記，可分別用于轉(zhuǎn)染效率的觀察以及抗生素篩選陽(yáng)性克隆。此外，載體多克隆的酶切位點(diǎn)中有一個(gè)Sac I酶切位點(diǎn)，我們?cè)诓迦氲腄NA片段中也設(shè)計(jì)了Sac I位點(diǎn)，當(dāng)片段插入正確時(shí)，質(zhì)粒就能被Sac I酶切出一條約916 bp的DNA小帶。經(jīng)酶切鑒定分析，構(gòu)建的重組質(zhì)粒酶切片段與預(yù)期大小一致。測(cè)序分析，3個(gè)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與初始設(shè)計(jì)完全一致，僅有1個(gè)重組質(zhì)粒的loop環(huán)上有3個(gè)堿基與初始設(shè)計(jì)不符，但不會(huì)影響干擾實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明4個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建有效。

將shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中是誘導(dǎo)RNAi發(fā)生的關(guān)鍵。我們將4個(gè)shRNA表達(dá)載體經(jīng)Poly JetTM轉(zhuǎn)染試劑包裹轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染組相比，各組均有熒光的表達(dá)，表明我們成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。RT－PCR和Western blotting結(jié)果均顯示PERK1 shRNA組PERK表達(dá)量最低，表明在蛋白和mRNA水平上PERK1 shRNA對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)有最明顯抑制效果。該結(jié)果也為下一步進(jìn)行L02細(xì)胞中PERK基因的功能研究奠定了有利的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Saito等［12］在成骨細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ERS反應(yīng)介導(dǎo)的PERK－eIF2α－ATF4通路參與細(xì)胞的分化過(guò)程。研究［2，3］發(fā)現(xiàn) PERK/ATF4/CHOP 通路在 ERS誘導(dǎo)的鼠INS－1和MIN6細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。許多肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。然而，PERK相關(guān)的信號(hào)通路是否參與了肝細(xì)胞的凋亡至今尚不清楚。本研究中流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，沉默了PERK基因的肝細(xì)胞ERS組較ERS組細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示PERK基因沉默對(duì)ERS狀態(tài)下肝細(xì)胞凋亡有抑制作用，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步應(yīng)用該表達(dá)載體深入研究PERK基因及其相關(guān)的信號(hào)通路在ERS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。

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