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      低氧性腎間質(zhì)纖維化和游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響*

      2011-07-31 14:05:46毛孫忠許芳芳胡良岡申屠楊萍范小芳龔永生
      中國(guó)病理生理雜志 2011年11期
      關(guān)鍵詞:低氧游泳纖維化

      毛孫忠,鄧 蔚,2,許芳芳,薛 峰,2,胡良岡,2,申屠楊萍,2,范小芳,2,龔永生,2△

      (溫州醫(yī)學(xué)院1低氧醫(yī)學(xué)研究所,肺心病研究室,2機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)教研室,浙江 溫州 325035)

      尾加壓素II(urotensin II,UⅡ)是迄今所知最強(qiáng)的縮血管活性肽[1],UⅡ及其受體——G蛋白偶聯(lián)受體14(G-protein-coupled receptor 14,GPR14)分布廣泛,在腦、腎、心及肺等均有表達(dá)。新近研究發(fā)現(xiàn):UⅡ作為一種具有絲裂原作用的自分泌/旁分泌因子,參與了糖尿病性腎纖維化的進(jìn)程[2];低氧可使機(jī)體UⅡ分泌增加[3],而低氧是慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一,UⅡ與低氧性腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低循環(huán)UⅡ的含量對(duì)自發(fā)性高血壓具有降壓作用[4],運(yùn)動(dòng)可否通過(guò)調(diào)節(jié)UⅡ/GPR14對(duì)低氧性腎間質(zhì)纖維化具有干預(yù)作用目前仍未明了。本研究旨在通過(guò)觀察慢性低氧性腎間質(zhì)纖維化大鼠UⅡ/GPR14的變化及游泳運(yùn)動(dòng)在其中的作用,以期為慢性低氧性腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的思路。

      材料和方法

      1 慢性低氧性腎纖維化大鼠模型的制備及處理

      清潔級(jí)雄性SD大鼠45只,體重300~350 g,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)均分成對(duì)照組、低氧組和游泳組。按以往的方法制備大鼠低氧模型[5],低氧組與游泳組置于自制常壓低氧艙內(nèi),艙內(nèi)吸入O2濃度9% ~11%,CO2濃度<3%,每天8 h,連續(xù)7周。游泳組在低氧3周后,于每天進(jìn)艙2 h前進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng),每次1 h,每天1次,共4周。游泳池為自制的圓形不銹鋼桶,內(nèi)徑50 cm,水溫為(33±2)℃,水深65 cm。對(duì)照組置于艙外,自由呼吸空氣,其它飼養(yǎng)條件相同。

      2 動(dòng)物處理

      動(dòng)物飼養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后,用戊巴比妥鈉(35 mg/kg,ip)麻醉,行左頸總動(dòng)脈插管取血,分別置入含肝素及預(yù)冷含10%EDTANa2、抑肽酶抗凝的試管中,4000 r/min 4℃離心10 min,取上清液-70℃保存待測(cè)。放血處死動(dòng)物后,取左腎組織約100 mg,待測(cè)組織羥脯氨酸的含量;取右腎組織約100 mg提取總RNA,待測(cè)UⅡ mRNA和GPR14 mRNA水平。

      每組隨機(jī)各取3只大鼠麻醉后,經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管,用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛各約500 mL先后灌注固定。開(kāi)腹,取右上半腎組織(橫切)置于4%多聚甲醛中進(jìn)一步固定24 h。按石蠟或冰凍切片技術(shù)要求取材、包埋、切片。

      3 血液和腎勻漿指標(biāo)的檢測(cè)

      化學(xué)比色法檢測(cè)血液尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)的含量;制備10%腎組織勻漿,化學(xué)比色法檢測(cè)腎組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量,以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。ELISA法測(cè)定血漿UⅡ含量,試劑盒由Phoenix Pharm aceuticals Inc.提供。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

      4 腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的檢測(cè)

      腎組織石蠟包埋切片,切片厚度約5 μm,苦味酸-酸性品紅(van Gieson,VG)染色觀察腎間質(zhì)纖維化情況(膠原纖維為鮮紅色)。試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。

      5 腎組織UⅡmRNA和GPR14 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

      采用RT-PCR法檢測(cè)腎組織 UⅡ mRNA和GPR14 mRNA的表達(dá)水平。Trizol一步法制備大鼠腎組織總RNA。常規(guī)PCR法擴(kuò)增產(chǎn)物,UⅡPCR引物的上、下游序列分別為5'-GAG CAG ACA CCC AGC CAG ACT T-3'和5'-TGC CCA GTG AGA GCC TTC CT-3'(PCR產(chǎn)物為306 bp,退火溫度為60℃);GPR14為5'-GCC TGG CTT GGT CAT TGG G-3'和5'-GCA GAG TGT AGA GGA AGG GAT TGA TG-3'(PCR產(chǎn)物為293 bp,退火溫度為68℃);β-actin為5'-CTG AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC -3'和5'- GTG CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC-3'(PCR產(chǎn)物為357 bp,退火溫度為68℃),引物均由賽百盛基因有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.25%瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)凝膠成像儀(Gene Genius)分析結(jié)果,分別計(jì)算UⅡ和GPR14 mRNA/β-actin條帶吸光度的比值作為其mRNA的相對(duì)含量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

      6 腎組織UⅡ蛋白的定位

      選擇右腎上半中部,應(yīng)用恒冷冰凍切片機(jī)橫位連續(xù)切片,厚約10 μm。免疫組織染色采用SP法,Ⅰ抗?jié)舛葹? mg/L,4℃過(guò)夜,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積。用PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。每個(gè)標(biāo)本取3張切片,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)非重復(fù)視野,光鏡下觀察腎小球單位及其腎小管染色情況,進(jìn)行定位研究。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)其平均吸光度值(absorbance,A)及累積吸光度值(IA)作為UⅡ蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

      7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      結(jié) 果

      1 BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較

      低氧組Scr和BUN含量較對(duì)照組分別低18.5%和14.1%(均P<0.05),而游泳組與低氧組間無(wú)顯著差別。低氧組腎組織Hyp含量比對(duì)照組高42.9%(P<0.01),而游泳組較低氧組低26.1%(均P<0.05)。低氧組血漿UⅡ含量較對(duì)照組高380.8%(P<0.01),而游泳組較低氧低42.6%(P<0.01),見(jiàn)表1。

      表1 各組BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較Table 1.Comparison of BUN,Scr,plasm UⅡ and Hyp in renal tissues in rats(.n=12)

      表1 各組BUN、Scr、血漿UⅡ和腎組織Hyp含量的比較Table 1.Comparison of BUN,Scr,plasm UⅡ and Hyp in renal tissues in rats(.n=12)

      *P <0.05,**P<0.01 vs control group;##P <0.01 vs hypoxia group.

      Group Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)Hyp(mg/g)UⅡ(μg/L)Control 57.2 ±11.0 10.55 ±1.60 0.408±0.045 2.13±0.67 Hypoxia 46.6 ±10.7* 9.06 ±1.47* 0.583±0.200** 10.24 ±1.27**Swimming 42.7 ±7.0 8.75 ±0.71 0.431±0.039## 5.88 ±0.91##

      2 腎組織UⅡmRNA和GPR14 mRNA表達(dá)的比較

      低氧組腎組織UⅡ mRNA表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)104.5%,而游泳組較低氧組下調(diào)33.2%(均 P<0.01);低氧組腎組織GPR14 mRNA較對(duì)照組上調(diào)35.4%(P<0.01),而游泳組與低氧組間無(wú)顯著差別(P >0.05),見(jiàn)表2、圖1。

      表2 各組腎組織UⅡ和GPR14 mRNA表達(dá)的比較Table 2.Comparison of the mRNA expression of UⅡ and GPR14 in renal tissues of rats(.n=9)

      表2 各組腎組織UⅡ和GPR14 mRNA表達(dá)的比較Table 2.Comparison of the mRNA expression of UⅡ and GPR14 in renal tissues of rats(.n=9)

      **P <0.01 vs control group;##P <0.01 vs hypoxia group.

      0.881 ±0.145 Control 0.337 ±0.041 0.593 ±0.022 Hypoxia 0.689 ± 0.035** 0.803 ± 0.073**Swimming 0.460 ±0.034##

      Figure 1.Results of RT-PCR for UⅡmRNA and GPR14 mRNA in renal tissues of rats.1:marker;2 ~ 4:control group;5~7:hypoxia group;8~10:swimming group.圖1 各組腎組織RT-PCR電泳結(jié)果

      3 腎組織UⅡ蛋白表達(dá)的比較

      免疫組化結(jié)果分析顯示低氧組腎組織UⅡ蛋白的A及IA值表達(dá)均較對(duì)照組明顯上調(diào)(P<0.01),而游泳組較低氧組明顯下調(diào)(P<0.01)。光鏡下觀察顯示:對(duì)照組大鼠腎組織棕黃色顆粒主要見(jiàn)于腎皮質(zhì)的腎小管上表達(dá),腎小球內(nèi)未見(jiàn)明顯表達(dá);低氧組腎組織棕黃色顆粒表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組,腎皮質(zhì)的腎小管上表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,腎小囊囊壁和腎血管內(nèi)皮細(xì)胞層可見(jiàn)少量表達(dá);游泳組棕黃色顆粒表達(dá)明顯低于低氧組,腎皮質(zhì)的腎小管上表達(dá)較強(qiáng)。陰性對(duì)照細(xì)胞胞核及胞膜呈藍(lán)色,胞漿及整片組織呈淡藍(lán)色,見(jiàn)表 3、圖2。

      表3 各組腎組織UⅡ蛋白含量的比較Table 3.Comparison of the protein expression of UⅡin renal tissues of rats(.n=12)

      表3 各組腎組織UⅡ蛋白含量的比較Table 3.Comparison of the protein expression of UⅡin renal tissues of rats(.n=12)

      **P <0.01 vs control group;##P <0.01 vs hypoxia group.

      Group A IA Control 0.205 ±0.045 2353 ±541 Hypoxia 0.461 ± 0.030** 5232 ±493**Swimming 0.299 ±0.031## 3422 ±525##

      4 腎組織VG染色觀察結(jié)果的比較

      光鏡觀察結(jié)果顯示,對(duì)照組腎血管及周?chē)?jiàn)少量鮮紅色染色,低氧組腎血管及周?chē)?jiàn)較多鮮紅色染色,即間質(zhì)細(xì)胞增生、膠原纖維明顯增多,游泳組腎血管及周?chē)r紅色染色面積較少,見(jiàn)圖3。

      Figure 3.Histopathological changes in renal tissues of rats(VG staining,×400).A:control group;B:hypoxia group;C:swimming group.圖3 各組腎組織病理學(xué)檢查

      討 論

      慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一組進(jìn)行性發(fā)展的慢性疾病,具有很高的死亡率和致殘率。腎間質(zhì)纖維化是CKD進(jìn)展到終末期時(shí)的共同病變過(guò)程,延緩或防止腎纖維化是防治CKD進(jìn)展的關(guān)鍵。低氧是慢性腎間質(zhì)纖維化發(fā)病重要的致病因素之一。有關(guān)低氧引起腎臟纖維化的機(jī)制目前尚不清楚,氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)失衡、炎癥反應(yīng)、增殖與凋亡等多因子、多因素都與該病理生理進(jìn)程有關(guān)[6]。目前認(rèn)為促纖維化細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β,TGF - β)、內(nèi)皮素1等,在其中起著非常重要的作用[7]。

      UⅡ是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮血管活性最強(qiáng)的多肽(較之前被認(rèn)為收縮血管活性最強(qiáng)的內(nèi)皮素-1還強(qiáng)6-28倍)。UⅡ及其受體GPR14在體內(nèi)分布廣泛,在心血管、腎臟、肺、神經(jīng)和內(nèi)分泌組織均有表達(dá)[8]。UⅡ可通過(guò)內(nèi)分泌、旁/自分泌的方式發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),對(duì)心腦血管穩(wěn)態(tài)、水鹽平衡及炎癥免疫等具有重要的調(diào)節(jié)作用,參與了高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等疾病的進(jìn)程[9]。新近研究發(fā)現(xiàn),UⅡ作為一種有絲裂原作用的自分泌/旁分泌的生長(zhǎng)因子,具有促細(xì)胞增殖和促細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)等效應(yīng)[10],UⅡ是否參與低氧性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程目前尚不清楚。羥脯氨酸是反映組織膠原含量的指標(biāo),膠原堆積是腎纖維化的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):慢性低氧大鼠腎臟組織羥脯氨酸含量較正常對(duì)照組顯著增高,VG染色顯示膠原纖維染色的強(qiáng)度和面積均明顯升高,同時(shí)血漿UⅡ含量顯著升高,腎組織UⅡ mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào),GPR14 mRNA的表達(dá)亦顯著性上調(diào),提示UⅡ/GPR14參與了慢性低氧致腎臟纖維化的進(jìn)程。Zhang等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)UⅡ與TGF-β介導(dǎo)的糖尿病性腎纖維化密切相關(guān)。

      目前臨床上根據(jù)腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制采取藥物干預(yù)方法,對(duì)延緩CKD的進(jìn)展、改善CKD預(yù)后取得了一定的療效,但仍有25%左右的CKD患者腎臟病變進(jìn)行性發(fā)展,因此改進(jìn)當(dāng)前單純藥物干預(yù)的治療方略尤顯重要。運(yùn)動(dòng)對(duì)腎臟功能的影響歷來(lái)為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)所重視。有研究表明,運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓具有降壓作用與其降低循環(huán)UⅡ含量有關(guān)[3],運(yùn)動(dòng)對(duì)低氧性腎間質(zhì)纖維化是否具有干預(yù)作用、該干預(yù)作用是否與UⅡ/GPR14有關(guān)目前尚未明了。研究表明,適度的有氧運(yùn)功可改善腎功能,而劇烈運(yùn)動(dòng)可引起腎損傷,甚至出現(xiàn)急性腎衰竭[11]。關(guān)宇光等[12]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可以降低血漿UⅡ含量,每天1 h無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練可使大鼠血漿UⅡ含量下降,而1次3%負(fù)重力竭游泳運(yùn)動(dòng)后血漿UⅡ含量卻顯著升高,故本實(shí)驗(yàn)大鼠每天游泳定為1 h無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。另外,Scr和BUN是反映腎功能的常用指標(biāo),急慢性腎功能衰竭時(shí)Scr和BUN均明顯增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)該強(qiáng)度下的游泳組大鼠BUN和Scr含量與其它組別無(wú)明顯差異。

      本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),游泳運(yùn)動(dòng)4周后,游泳組大鼠腎組織羥脯氨酸值較低氧組顯著降低,VG染色顯示膠原纖維染色強(qiáng)度及面積也明顯降低,提示長(zhǎng)期適度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性低氧腎間質(zhì)纖維化具有防治作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),游泳組大鼠血漿UⅡ含量較低氧組顯著降低,腎組織UⅡmRNA和蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào),而GPR14 mRNA的表達(dá)2組間無(wú)顯著差異。有報(bào)道,運(yùn)動(dòng)可降低血漿UⅡ含量對(duì)自發(fā)性高血壓具有降壓作用[4],提示適度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性低氧腎間質(zhì)纖維化的防治作用與降低循環(huán)UⅡ含量和改善腎組織UⅡ的表達(dá)有關(guān)。長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)后,循環(huán)中UⅡ含量的降低一方面可通過(guò)降低UⅡ?qū)ρ艿闹苯邮湛s作用和改善縮/舒血管活性物質(zhì)失衡[8],進(jìn)而促進(jìn)腎臟血供,緩解腎缺血缺氧癥狀;另一方面減弱UⅡ促增殖作用及對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的促絲裂原作用,改善腎臟組織促纖維化細(xì)胞因子與抗纖維化細(xì)胞因子(如間質(zhì)金屬蛋白酶-2)間的失衡,緩解腎上皮細(xì)胞間質(zhì)化和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的發(fā)生[7],進(jìn)而延緩腎纖維化的進(jìn)程。今后可以通過(guò)或配合與UⅡ生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)的拮抗劑來(lái)達(dá)到強(qiáng)化防治低氧性腎間質(zhì)纖維化的效果,有待進(jìn)一步的研究。

      本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:慢性低氧性腎纖維化大鼠UⅡ及其受體的表達(dá)上調(diào);適度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性低氧腎間質(zhì)纖維化具有防治作用,并下調(diào)UⅡmRNA與蛋白的表達(dá),推測(cè)該作用可能與調(diào)節(jié)UⅡ的表達(dá)有關(guān),但尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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