2－脫氧－D－葡萄糖與奧沙利鉑對(duì)人肝癌SMMC－7721 細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

耿 翔， 周 奇， 劉 超， 尚 闖， 龐志剛△

(1 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，河南 鄭州450003;2 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州510080)

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危及人類的身心健康。全身化療作為肝癌綜合治療的重要組成部分，目前的臨床治療效果卻并不理想。這其中的原因既包括現(xiàn)有化療藥物藥效不佳、毒副作用大，又包括肝癌細(xì)胞易被誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性等。因此尋求新的治療藥物、制定新的化療方案已成為當(dāng)前肝癌治療的研究熱點(diǎn)［1］。研究發(fā)現(xiàn)2－脫氧－D－葡萄糖(2－deoxy－D－glucose，2－DG)作為一種糖酵解抑制劑，能夠通過影響腫瘤細(xì)胞能量的合成，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［2］。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了2－DG與奧沙利鉑(oxaliplatin，L－OHP)單藥及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC－7721 增殖及凋亡的影響，以期能夠?yàn)楦伟┑闹委熖峁┬碌乃悸泛蛯?shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細(xì)胞SMMC－7721 由河南省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與。四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl terazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethlsulfoxide，DMSO)和2－DG 均購(gòu)自Sigma，L－OHP 為南京制藥廠出產(chǎn)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V－FITC/PI 購(gòu)于聯(lián)科生物工程有限公司，caspase－3 試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、2－DG 組、L－OHP 組及2－DG 聯(lián)合L－OHP 組。各實(shí)驗(yàn)組除藥物劑量不同外培養(yǎng)環(huán)境相同。在檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率時(shí)，將2－DG 按濃度分為6 mmol/L、12 mmol/L 和24 mmol/L 3 組;將L－OHP 按濃度分為10 μmol/L、20 μmol/L 和40 μmol/L 3 組;聯(lián)合用藥組也按濃度分為6 mmol/L 2－DG 聯(lián)合10 μmol/L L－OHP、12 mmol/L 2－DG 聯(lián) 合 20 μmol/L L－OHP、24 mmol/L 2－DG 聯(lián)合40 μmol/L L－OHP 3 組。在檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率以及caspase－3 活性時(shí)，藥物濃度2－DG 均為12 mmol/L，L－OHP 均為20 μmol/L。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC－7721 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將SMMC－7721 細(xì)胞以3 ×104/well 密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入各組藥物，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。加藥后分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定各孔的吸光度(A)值，以計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=［(空白對(duì)照組A 值－實(shí)驗(yàn)組A 值)/空白對(duì)照組A 值］× 100%。采用協(xié)同作用q 值［3］判斷2－DG和L－OHP 聯(lián)合應(yīng)用的性質(zhì):q =EAB/(EA+EB－EA×EB)。式中EAB為兩藥合用抑制率，EA和EB為各藥單用抑制率，q ＞1.15 示兩藥有協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15 示兩藥有相加作用，q ＜0.85 示兩藥有拮抗作用。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率 調(diào)整細(xì)胞濃度為5 ×108/L，種植于6 孔板中。藥物處理48 h 后采用PI 染色法行細(xì)胞周期檢測(cè):胰酶消化6 孔板中細(xì)胞后將其移至離心管中，加入PBS 液，1 000 r/min 離心10 min，前后離心2 次。室溫避光PI 染色30 min 后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。給藥48 h后采用Annexin V－FITC/PI 雙染色法行細(xì)胞凋亡率檢測(cè):藥物作用48 h 后，消化、離心方法同前，加入1 mL binding buffer 后再加入10 μL Annexin V－FITC和5 μL PI，避光室溫反應(yīng)15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5 Caspase－3 活性測(cè)定 給藥處理24 h 后，收集各組細(xì)胞3 ×106個(gè)，600 r/min 于4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞，吸除上清，PBS 洗滌1 次。加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4 ℃離心10 min 后把上清轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中。加緩沖液混勻，加10μL Ac－DEVD－pNA (2 mmol/L)后混勻。37 ℃孵育100 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在405 nm 處測(cè)定A 值。結(jié)果以吸光度(A)值的比值(實(shí)驗(yàn)組A 值/空白對(duì)照組A 值)表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MTT 檢測(cè)藥物對(duì)SMMC－7721 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

2－DG 和L－OHP 單藥及聯(lián)合用藥對(duì)肝癌細(xì)胞均具有增殖抑制作用。同一濃度不同時(shí)間，或同一時(shí)間不同藥物濃度，各組間抑制率相比較差異均顯著(P ＜0.05)，呈時(shí)間劑量依賴性;聯(lián)合用藥后3 個(gè)時(shí)段的協(xié)同作用q 值均＞0.85，提示兩藥具有協(xié)同、相加作用，見表1。

表1 2－DG 與L－OHP 對(duì)肝癌SMMC－7721 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Table 1. The inhibitory rates of 2－DG and/or L－OHP on the growth of SMMC－7721 cells at different time points(%. ±s.n=6)

表1 2－DG 與L－OHP 對(duì)肝癌SMMC－7721 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Table 1. The inhibitory rates of 2－DG and/or L－OHP on the growth of SMMC－7721 cells at different time points(%. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs other groups at the same time point;#P ＜0.05 vs the same group at 24 h.The numbers in the parentheses of combination group are q values.

Group 24 h 48 h 72 h Control 0 0 0 L－OHP(10 μmol/L) 17.47 ±6.91 28.66 ±2.51# 37.31 ±3.46#L－OHP(20 μmol/L) 43.96 ±1.16 51.76 ±1.01# 60.62 ±1.29#L－OHP(40 μmol/L) 56.23 ±0.89 75.29 ±2.05# 89.56 ±0.60#2－DG(6 mmol/L) 12.72 ±5.27 21.19 ±2.81# 33.29 ±1.73#2－DG(12 mmol/L) 25.95 ±1.71 32.11 ±1.62# 47.10 ±1.08#2－DG(24 mmol/L) 37.76 ±2.44 46.29 ±2.04# 73.20 ±7.05#L－OHP(10 μmol/L)+2－DG(6 mmol/L) 39.32 ±3.21* (1.40) 50.52 ±3.14* #(1.16) 69.53 ±1.43* #(1.17)L－OHP(20 μmol/L)+2－DG(12 mmol/L) 72.95 ±2.27* (1.24) 77.72 ±2.96* #(1.16) 91.66 ±0.28* #(1.15)L－OHP(40 μmol/L)+2－DG(24 mmol/L) 82.13 ±1.02* (1.16) 87.78 ±1.46* #(1.01) 94.40 ±0.13* #(0.97)

2 2－DG 和L－OHP 單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SMMC－7721 細(xì)胞周期的影響

2－DG 單藥作用可使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。L－OHP 單藥應(yīng)用主要使細(xì)胞阻滯于S 期。聯(lián)合用藥后，細(xì)胞被阻滯于S 及G2/M 期(P ＜0.05)，見表2、圖1。

Figure 1. Cell cycle determined by flow cytometry. A:control group;B:2－DG group;C:L－OHP group;D:2－DC + L－OHP group.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

表2 2－DG 與L－OHP 對(duì)SMMC－7721 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響Table 2. The effects of 2－DG and/or L－OHP on the cell cycle and apoptotic rate of SMMC－7721 cells(%.±s.n=6)

表2 2－DG 與L－OHP 對(duì)SMMC－7721 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響Table 2. The effects of 2－DG and/or L－OHP on the cell cycle and apoptotic rate of SMMC－7721 cells(%.±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control group.

Group G0/G1 S G2/M Apoptotic rate Control 77.91±3.68 15.60±1.73 6.49±1.61 1.10±0.13 2－DG(12 mmol/L) 57.64±3.32* 18.88±2.44 23.48±3.22* 19.00±1.22*L－OHP(20 μmol/L) 33.14±1.10* 55.87±2.32* 10.99±2.31 27.00±2.13*L－OHP(20 μmol/L)+2－DG(12 mmol/L) 25.57±3.52* 62.68±2.64* 11.75±1.91* 42.20±2.51*

3 2－DG 和L－OHP 單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SMMC－7721 細(xì)胞凋亡的影響

2－DG 與L－OHP 單藥組的凋亡率大于對(duì)照組;聯(lián)合用藥組凋亡率大于單藥組，差異均顯著(P＜0.05)，見表2、圖2。

4 2－DG 及L－OHP 單藥聯(lián)合用藥對(duì)SMMC－7721 細(xì)胞caspase－3 活性的影響

應(yīng)用caspase－3 活性試劑盒檢測(cè)caspase－3 活性，結(jié)果表明2－DG 作用于細(xì)胞后，caspase－3 的活性增加;而聯(lián)合用藥組則能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC－7721 的caspase－3 活性明顯增強(qiáng)，見表3。

Figure 2. Apoptosis detected by flow cytometry.A:control group;B:2－DG group;C:L－OHP group;D:2－DG+L－OHP group.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表3 Caspase－3 活性的變化Table 3. The changes in caspase－3 activity(±s.n=3)

表3 Caspase－3 活性的變化Table 3. The changes in caspase－3 activity(±s.n=3)

* P ＜0.05 vs other groups.

Group Caspase－3 activity Control 1.00 2－DG(12 mmol/L) 1.53 ±0.07 L－OHP(20μmol/L) 1.93 ±0.10 L－OHP(20μmol/L)+2－DG(12 mmol/L) 2.60 ±0.05*

討 論

大多數(shù)正常細(xì)胞在有氧狀態(tài)下是以糖的有氧分解作為獲得能量的主要方式，只有在缺氧時(shí)才依靠無氧糖酵解供能。而腫瘤細(xì)胞卻與之不同。1924年，德國(guó)生物化學(xué)家奧托·海因里?！ね卟└?Otto Heinrich Warburg)發(fā)現(xiàn)并描述了腫瘤細(xì)胞的能量代謝特點(diǎn)，即腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也會(huì)更傾向于通過無氧糖酵解的途徑來獲取能量，這便是著名的瓦博格效應(yīng)(Warburg effect)［4］。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，瓦博格效應(yīng)的正確性以及在腫瘤細(xì)胞中的普遍性已經(jīng)逐步得到了證實(shí)［5］，盡管其確切的形成機(jī)制還未被闡明，但是它對(duì)腫瘤細(xì)胞的能量代謝特點(diǎn)的描述已經(jīng)為針對(duì)糖酵解途徑的靶向治療提供了理論依據(jù)和治療契機(jī)。

基于對(duì)瓦博格效應(yīng)的理解，人們意識(shí)到如果對(duì)癌癥病人施以糖酵解抑制治療，則治療用藥將會(huì)更針對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小。這樣的治療方式在突出靶向治療理念的同時(shí)，也通過不同于常規(guī)化療藥物的作用途徑達(dá)到治療腫瘤的目的。作為糖酵解抑制劑的一種，2－DG 潛在的抗癌效果正逐步得到人們的重視。有關(guān)研究顯示2－DG在進(jìn)入細(xì)胞后，可被糖酵解的限速酶己糖激酶磷酸化為磷酸脫氧葡萄糖，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制己糖激酶與葡萄糖的反應(yīng)，減少6－磷酸葡萄糖合成，限制糖酵解后續(xù)反應(yīng)的發(fā)生，降低了糖酵解過程中的ATP 形成，通過影響細(xì)胞的能量代謝最終抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)［6］。已有研究顯示2－DG 對(duì)乳腺癌、胰腺癌等癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖都能起到較好的抑制作用［7、8］，其不僅可作為放射治療的輔助用藥提高放療的敏感性，而且在與順鉑、阿霉素、紫杉醇等常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)均能夠提高相關(guān)藥物的抗腫瘤作用。為進(jìn)一步了解2－DG 對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效果以及其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)并開展了此次實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的2－DG 均對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC－7721 的生長(zhǎng)具有抑制作用，并且這種抑制作用隨著藥物濃度和用藥時(shí)間的增加逐步提高。實(shí)驗(yàn)中2－DG 能夠誘導(dǎo)SMMC－7721 細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞周期主要阻滯在DNA 合成的后期和有絲分裂期，我們考慮作為能量抑制劑的2－DG，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響可能需要等到ATP 耗竭達(dá)到一定的程度時(shí)才會(huì)產(chǎn)生抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在實(shí)驗(yàn)中2－DG 與L－OHP 聯(lián)合用藥組表現(xiàn)了較好的腫瘤抑制效果，兩藥顯示出了協(xié)同、相加效應(yīng)。兩藥聯(lián)合應(yīng)用后能阻滯SMMC－7721 細(xì)胞于S 期及G2/M 期，并較單藥組更好的誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞的凋亡?；熕幬飳?duì)DNA 的破壞會(huì)造成與糖酵解有關(guān)的酶的合成減少，從而影響到腫瘤細(xì)胞自身的能量供應(yīng)［9］;而由此以及糖酵解抑制所導(dǎo)致的能量生成減少又勢(shì)必會(huì)影響DNA 修復(fù)酶修復(fù)被破壞DNA 時(shí)對(duì)能量的需求。這樣一個(gè)惡性循環(huán)過程的形成，使不同作用機(jī)制的兩藥最終加速了細(xì)胞的死亡。

Caspase 家族是一類半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶?；罨腸aspase－3 作為該家族中的一員是凋亡過程中一個(gè)重要的執(zhí)行蛋白，對(duì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與調(diào)節(jié)起重要作用，其活性的表達(dá)與細(xì)胞凋亡程度呈現(xiàn)出正相關(guān)性［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到2－DG 作用于SMMC－7721 細(xì)胞后caspase－3 活性明顯高于對(duì)照組;同時(shí)2－DG 對(duì)L－OHP 誘導(dǎo)的細(xì)胞caspase－3 活性增加有明顯的促進(jìn)作用。據(jù)此我們認(rèn)為caspase－3 參與了2－DG 和L－OHP 誘導(dǎo)SMMC－7721 細(xì)胞凋亡的調(diào)控，通過其活性的激活最終導(dǎo)致了凋亡的增加。有關(guān)這一過程的具體作用機(jī)制目前還不明確，尚有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，此次體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們驗(yàn)證了2－DG對(duì)肝癌細(xì)胞治療的有效性，也了解到其與化療藥奧沙利鉑合用應(yīng)用所具有的協(xié)同效應(yīng)，這些都讓我們?yōu)?－DG 潛在的臨床價(jià)值充滿期待。由于缺氧是實(shí)體腫瘤在體內(nèi)的常見狀態(tài)，同時(shí)缺氧條件下的肝癌細(xì)胞將會(huì)比常氧條件的細(xì)胞更傾向、更依賴無氧糖酵解來獲取能量，我們下一步的研究將會(huì)針對(duì)2－DG 單藥及與奧沙利鉑合用對(duì)缺氧狀態(tài)的肝癌細(xì)胞的影響以及進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)而展開。

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