(北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038)

單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是趨化因子家族中的主要成員之一，在腫瘤、炎癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變等新生血管性疾病中，MCP-1起著重要的作用。它與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)共同參與新生血管的形成［1］，VEGF 可通過激活核因子(NF)-κB、活化蛋白(AP)-1而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1［2］，而MCP-1可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的高親和受體CCR2，與G蛋白結(jié)合，趨化內(nèi)皮細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng);同時(shí)MCP-1可趨化腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)進(jìn)入組織，分泌VEGF等，間接刺激腫瘤新生血管生成。而許多致盲性視網(wǎng)膜疾病都與新生血管的產(chǎn)生有關(guān)。2010年6～7月，我們觀察了新生小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中MCP-1的表達(dá)，探討其在血管形成過程中的作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J幼鼠(3、5、7、12、14、21日齡小鼠各10只)60只，雌雄不限，均為無特定病原體級(jí)(SPF級(jí))，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將所有小鼠按日齡(3、5、7、12、14、21日)分別處死。立即摘除眼球，冰上分離視網(wǎng)膜，分別采用RT-PCR和Western blot法、免疫組化染色檢測(cè)MCP-1 mRNA和蛋白。①RT-PCR檢測(cè):取部分視網(wǎng)膜組織，用Trizol試劑提取總RNA，RNA定量后參照文獻(xiàn)［3］的方法，用一步法 PCR試劑盒。MCP-1上游引物:5'-CTGGACCCAACTGCAACTGCTT-3'，MCP-1 下游引物:5'-ACTGGCCTTCGGTTTCCTTATC-3'，擴(kuò)增片段 544 bp;β-actin 上游引物:5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3'，β-actin 下游引物:5'-TCCAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3'，擴(kuò)增片段316 bp。合成 cDNA，PCR擴(kuò)增過程:55℃、30 min，預(yù)變性94℃、2 min，變性94 ℃、15 s，退火57 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，后延伸72℃、10 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用圖像分析儀進(jìn)行圖像分析。所得結(jié)果與β-actin的比值為MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。每樣品實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。②Western blot檢測(cè):取部分視網(wǎng)膜組織，提取總蛋白，參照文獻(xiàn)［3］，將定影后的X線膠片用JVCKy-F30B圖像攝錄輸入儀掃描，KONTRONIBAS2.0全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(德國Koutron公司)進(jìn)行半定量分析。所得結(jié)果與內(nèi)參照GAPDH的比值為MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。每樣品實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值。③免疫組化SP染色:取部分視網(wǎng)膜組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，5～7 μm厚切片。采用免疫組化SP法染色。按試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)說明書操作，一抗為單克隆小鼠抗小鼠MCP-1抗體，由美國Santa Cruz公司提供。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或黃色為陽性結(jié)果。采用Olympus熒光照像顯微鏡照相，用圖像分析軟件(Image-Pro Plus，version 4.5 for Windows)分析陽性細(xì)胞平均OD值。

2 結(jié)果

3日齡小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層即有MCP-1蛋白表達(dá)(陽性細(xì)胞平均OD值為0.083±0.007)，隨著視網(wǎng)膜血管的發(fā)育，12日齡時(shí)MCP-1蛋白陽性細(xì)胞明顯增多，陽性細(xì)胞平均OD值為0.199±0.015(P ＜0.05)，其他日齡時(shí) MCP-1 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)呈基線表達(dá)。

不同日齡小鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1 mRNA、蛋白表達(dá)結(jié)果見圖1。MCP-1 mRNA和蛋白在3日齡小鼠視網(wǎng)膜組織中即有表達(dá)，12日齡時(shí)呈現(xiàn)一過性高表達(dá)(P＜0.05)，之后迅速下降，21日齡時(shí)表達(dá)基本呈基線水平。

圖1 不同日齡小鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1 mRNA、蛋白表達(dá)

3 討論

研究表明小鼠等嚙齒類哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜血管在出生后才開始由視盤發(fā)育，同時(shí)玻璃體血管退化，12日齡時(shí)視網(wǎng)膜淺層血管發(fā)育完全，玻璃體血管完全退化［4］，并可以通過眼底鏡和熒光血管造影觀察其發(fā)育過程［5］，因此小鼠成為研究血管形成的理想動(dòng)物模型。

MCP-1是單核細(xì)胞趨化的重要趨化因子，為76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽段，可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生，其受體為CCR2，分布在單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞膜上，是一類含7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體超家族(GPCRs)，胞內(nèi)區(qū)與 G蛋白偶聯(lián)。當(dāng) MCP-1與CCR2結(jié)合后，受體變構(gòu)與G蛋白結(jié)合，胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加、激活磷脂酶 C以及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)等多種激酶，在其信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用［6］。

研究表明MCP-1具有趨化單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞聚集并激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用，不僅是參與炎癥的重要因子，還參與正常血管發(fā)育和病理性新生血管形成［2］。小鼠的視網(wǎng)膜血管在出生后開始由視盤發(fā)育，同時(shí)玻璃體血管開始退化。本研究顯示，新生小鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)變化與文獻(xiàn)［5］報(bào)道的小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程相吻合，在出生后第3天的小鼠視網(wǎng)膜組織中即可檢測(cè)到MCP-1;生后第7天小鼠玻璃體動(dòng)脈退化的程度最大，視網(wǎng)膜血管部分發(fā)育［5］，生后第7天小鼠視網(wǎng)膜組織中MCP-1表達(dá)較第3天時(shí)略高;12日齡小鼠視網(wǎng)膜淺層血管發(fā)育完全，玻璃體血管完全退化，而此時(shí)視網(wǎng)膜組織中MCP-1的表達(dá)達(dá)到高峰;隨著視網(wǎng)膜血管的發(fā)育成熟，MCP-1的表達(dá)逐漸降低，在14、21日齡呈基線表達(dá)。

有研究發(fā)現(xiàn)［7，8］，在許多以血管生成為特點(diǎn)的疾病中，MCP-1表達(dá)增高。①M(fèi)CP-1直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的CCR2，趨化內(nèi)皮細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)血管形成;②MCP-1趨化血管平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)TGF-β的分泌，對(duì)血管生成起中介作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在無炎癥情況下，MCP-1在小鼠的視網(wǎng)膜血管發(fā)育過程中的視網(wǎng)膜組織中均有表達(dá)，且表達(dá)量與視網(wǎng)膜血管發(fā)育的成熟程度和生長(zhǎng)速度同步，間接證明了MCP-1與小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育有關(guān)，對(duì)視網(wǎng)膜血管的發(fā)育起作用。

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